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冷皂化—高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的5种顺反式异构体 摘要建立了冷皂化高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的5种顺反式异构体将乳制品进展冷皂化处理后，经正己烷石油醚二氯甲烷〔2∶2∶1，V/V〕提取，使用YMCC30色谱柱别离，以甲醇和甲基叔丁基醚为流动相进展梯度洗脱，采用二极管阵列检测器于445nm波长下检测，外标法定量；在0.127～5.082mg/L范围内的线性关系良好，相关系数〔R2〕为0.9999，回收率在96.7%～102.2%之间，RSD在4.1%～5.4%之间〔n=6〕，检出限为0.010μg/g〔S/N=3〕，定量限为0.030μg/g〔S/N=10〕本方法简单、准确、灵敏度高，适用于乳制品中叶黄素5种异构体的检测关键词高效液相色谱法；叶黄素；异构体；乳制品1引言叶黄素〔Lutein〕，又名黄体素，是存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中的天然类胡萝卜素叶黄素具有良好的预防人体衰老、动脉硬化【1】、抗氧化、抗癌成效【2】以及独特的护眼功能[3，4]等，在保健品、化装品和动禽类饲料等多个领域广泛应用美国FDA于1995年批准了叶黄素作为食品补充剂用于食品中，我国2021年批准了叶黄素作为营养强化剂添加到婴幼儿或儿童配方食品中【5】。

叶黄素分子构造中含多个共轭碳碳双键构造，由于烯键的存在，叶黄素可以存在多种几何异构体叶黄素不同异构体在生物体内的生物活性也不同，其中全反式构象的生物活性较顺式构象要高很多[6，7]目前市售的食品中很少有区分叶黄素不同异构体的含量因此，建立高效的叶黄素顺反异构体的检测方法具有重要的意义目前叶黄素的检测方法主要以高效液相色谱法[8～10]和液质联用法[11，12]为主由于叶黄素在光和热的作用下容易发生顺反异构化[13，14]，因此样品的所有处理过程需在较低温度和避光条件下进展，防止全反式叶黄素发生异构化所以到目前为止，国际市场上也只有全反式叶黄素标准物质在售，尚未有叶黄素顺式异构体的标准物质，对顺式异构体进展定量仍然是一个难题本研究采用全反式叶黄素作为标准物质，对5种叶黄素异构体进展定量分析，并且对样品的前处理方法进展了研究，采用冷皂化法进展样品的前处理，防止叶黄素在高温皂化时叶黄素发生异构化，采用液相色谱法结合YMCC30色谱柱对叶黄素异构体进展有效别离，准确定量2实验部分2.1仪器与试剂Agilent1260高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器〔美国Agilent公司〕；紫外/可见分光光度计；乙腈、甲醇〔色谱纯，Merk公司〕；甲基叔丁基醚、石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、四氢呋喃〔色谱纯，Tedia公司〕；2，6二叔丁基对甲苯酚〔BHT，纯度99.4%，SigmaAldrich公司〕；KOH〔纯度>80%，SigmaAldrich公司〕；实验用水为MilliQ超纯水。

全反式叶黄素标准标准标准品于100.0mL容量瓶中，用含0.003%BHT的乙醇溶解并定容该溶液可在40℃下完好保存6个月准确汲取叶黄素标准储藏液用含0.003%BHT乙醇配制成标准系列溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ采用分光光度法[15]和高效液相色谱峰面积归一法校准标准系列溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的浓度分别为5.082，2.033，1.016，0.254和0.127mg/L2.3色谱条件液相色谱柱：YMCC30色谱柱〔250mm×4.6mm，3.5μm，YMC公司〕；柱温：25℃；进样量：100μL；以甲醇〔A〕和甲基叔丁基醚〔B〕为流动相，梯度洗脱：0.0～14.0min，85%A，15%B；14.0～15.0min，90%A，10%B；15.0～18.0min，10%A，90%B；18.0～22min，85%A，15%B流速1.0mL/min；检测波长：445nm，参考波长：550nm2.4样品前处理样品的前处理过程都要在避光或者在经对紫外光过滤的灯光下进展，以防止叶黄素发生异构化称取粉末样品2g〔准确到0.001g〕或液态样品10g〔准确到0.001g〕，置于50.0mL离心管中，〔粉末样品参加10mL实验室用水，充分涡旋2min〕，参加四氢呋喃5mL，涡旋混匀，参加5%KOH甲醇溶液10mL，漩涡振荡1min，于摇床上室温振荡反响30min，反响方法定量原理叶黄素属于类胡萝卜素，其分子式为C40H56O2，分子量为568.9，热处理时，全反式叶黄素异构化成为顺式叶黄素异构体，其中最常见的是13顺式叶黄素、13′顺式叶黄素和9顺式叶黄素、9′顺式叶黄素，叶黄素也易被氧化及光诱导异构化，因此，实验过程必须与氧气和白光隔绝，并且所有操作在室温下进展，全反式叶黄素的构造如图1所示。

由于叶黄素容易发生异构化，难以获得顺式叶黄素标准物质有报道采用全反式叶黄素制备顺式叶黄素标准物质的方法，方法虽然可行，但是不适用于检测机构日常检测工作顺式叶黄素与反式叶黄素在445nm的吸光系数存在着差异，在定量顺式叶黄素异构体，以反式叶黄素为标准差异，因此本实验通过在445nm下得到的顺式叶黄素峰面积与全反式叶黄素标准品的峰面积相比，从而实现对全反式叶黄素的定量分析，也可以对4种顺式叶黄素和全反式叶黄素同时进展计算，最终计算总叶黄素含量3.2色谱条件的优化与叶黄素异构体的定性C18色谱柱和C30色谱柱都可以用来检测类胡萝卜素，但是C18色谱一般用于分析类胡萝卜素的总量，而C30色谱柱具有良好的峰形和较长的保存时间等优越的性能，通常用于类胡萝卜素的顺反异构体的别离本研究参考了文献[16]的方法对全反式叶黄素进展异构化反响将1mg反式叶黄素用少量甲苯溶解后，参加2mg/L碘正己烷溶液，使碘的含量为叶黄素质量的2%，将混合液放在40W日光灯下光照1h，然后用1mol/L硫代硫酸钠溶液洗涤2次，除去多余的碘，有机相在30℃下氮气吹干后，用含0.003%BHT的乙醇溶液复溶，定容至10.0mL，得到顺式和反式叶黄素混合样品，用于叶黄素的定性分析。

为了消除上一个色谱样品杂质对下一个色谱样品目的物的干扰，在目的物完全洗脱后，采用大比例的甲基叔丁基醚对色谱柱进展洗脱，保证可能存在杂质完全被洗脱出来后不干扰下一个样品的检测在液相色谱系统中，对5种叶黄素异构体的紫外可见光谱图进展全扫描，叶黄素5种异构体的紫外可见光谱的吸收波长见表1，9顺式和13顺式构造与全反式构造的叶黄素的最大吸收波长相差约4nm，这是由于顺式构造叶黄素发生了紫移现象，与文献[8]报道一致通过光谱对照并参照采用YMCC30色谱柱实现叶黄素5种顺反异构体完全别离的文献[8，17，18]，对叶黄素5种异构体进展定性分析全反式叶黄素标准样品如图2a所示，经过异构化处理的叶黄素标准样品中叶黄素5种顺反异构体如图2b所示，各种叶黄素异构体的别离效果良好由于叶黄素标准对照品在运输和转移过程中，不可防止会受光和热影响，全反式叶黄素会发生微量的异构化，因此采用面积归一化法得到全反式叶黄素的含量，从而消除方法的优化叶黄素对光和热都很敏感，操作过程要避光且防止高温，因此实验在常温下对样品进展皂化，使用甲醇KOH溶液作为皂化液的皂化效果优于KOH水溶液，减少了水溶液的稀释作用，同时甲醇作为有机溶剂参加，有利于溶解叶黄素。

为了防止提取过程中发生乳化，促进叶黄素的溶解，进步皂化效率，在皂化过程参加四氢呋喃使用石油醚、正己烷、二氯甲烷作为提取溶剂，发现3种试剂混合提取时效果较好；考察了不同比例的混合溶液的提取效率发现，当石油醚正己烷二氯甲烷〔2∶2∶1，V/V〕时，提取效率高，并且提取溶剂在提取液上层，有利于提取操作，减少了样品基质的干扰作用不同萃取溶剂的萃取效果见表2本研究采用石油醚正己烷二氯甲烷〔2∶2∶1，V/V〕溶液作为提取液3.4线性范围、检出限和定量限对全反式叶黄素标准液进展检测，以仪器响应的峰面积A对全反式叶黄素的质量浓度C进展线性回归，在0.127～5.082mg/L范围内的线性关系良好，回归方程为A=1368.4C-9.7，相关系数〔R2〕为0.9999在空白样品中添加叶黄素标准品，以S/N=3确定方法的检出限，以S/N=10确定方法的定量限，得到叶黄素的检出限为0.010μg/g，定量限为0.030μg/g3.5回收率和精细度对不含叶黄素乳粉样品进展全反式叶黄素回收率实验，添加程度分别为0.200，0.500和1.000μg/g，采用优化后的前处理方法对样品进展处理，每个添加程度重复6次，平均回收率分别为97.5%，102.2%和96.7%，RSD分别为5.4%，4.3%和4.1%。

3.6实际样品测定4结论建立了乳制品中叶黄素5种顺反异构体的高效液相色谱法采用冷皂化前处理，保证样品在皂化过程中叶黄素能保持原有的构型，使用YMCC30色谱柱对叶黄素5种顺反异构体进展了有效别离，4种顺式异构体根据反式叶黄素标准物质进展准确定量分析方法简单快速，准确度和精细度高，适用于乳制品中叶黄素5种顺反异构体的定量检测References1RaoAV，RaoLG.Pharmacol.Res.，2021，55：207-2162DruesnePecolloN，LatinoMartelP，NoratT，BarrandonE，BertraisS，GalanP，HercbergS.Int.J.Cancer，2021，127〔1〕：172-1843BeattyS，BoultonM，HensonD，KobHH，MurrayIJ.Br.J.Ophthalmol.，1999，83：867-8774BerendschotTT，GoldbohmRA，KlppingWA，vandeKraatsJ，vanNorelJ，vanNorrenD.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，2000，41〔11〕：3322-33265MinistryofHealth2022No.8BulletinoftheMinistryofHealthofThePeople′sRepublicofChina. moh.gov /business/htmlfiles/mohwsjdj/pggtg/20212021年第8号公告6BohmV，PuspitasariNienaberNL，FerruzziMG，SchwartzSJ.J.Agric.FoodChem.，2021，50〔1〕：221-2267KhachikF，BernsteinPS，GarlandDL.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，1997，38〔9〕：1802-18118AmanR，BiehlJ，CarleR，ConradJ，BeifussU，SchieberA.FoodChem.，2021，92：753-7639WANGLiNa，HUANGJunRong，ZHANGLi，FENGFeng，LINGYun，CHUXiaoGang，LIHongLiang.ChineseJournalofChromatography，2021，31：1228-1231王丽娜，黄峻榕，张立，冯峰，凌云，储晓刚，李宏梁.色谱，2021，31〔12〕：1228-123110HsuBY，PuYS，StephenInbarajB，ChenBH.J.Chromatogr.B，2021，899：36-4511DachtlerM，GlaserT，KohlerK，AlbertK.Anal.Chem.，2021，73：667-67412ElenaMO，DmasoHM.FoodChem.，2021，135〔3〕：1344-135213MarxM，StuparicM，SchieberA，CarleR.FoodChem.，2021，83：609-61714CastenmillerJJM，WestCE.Annu.Rev.Nutr.，1998，18：19-3815CraftNE.J.Agric.FoodChem.，1992，40：431-43416EmenhiserC，EnglertG，SanderLC，LudwigB，Schwa。