免疫双向扩散实验-新修订.pdf

双向扩散法抗原分析双向扩散法抗原分析 【原理】 双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线 的方法 沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例， 而且与其分 子大小及扩散速度相关当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应 【材料】 生理盐水 1%琼脂管（每管约 4ml） 载玻片 打孔器及打孔模板 微量加样器及塑料吸头 抗体及抗原 1、2、3、4、5、6 湿盒 【方法】 1将已溶化的 1%琼脂盐水管放 5660水浴箱中平衡温度备用 2将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂 3.54ml，使成厚度约 1.5mm 琼脂板 3凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、 方阵型或梅花型本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组 （因本次实验所 制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成 两组 否则， 如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或 抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结 果） 。

4用微量加样器加抗体各 10l各组所余两孔各按抗原 1、2 为一组，3、4 为二组，5、6 为三组，分别各加入 10l注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影 响实验结果 5作好记录，放湿盒中，置 37温箱，24 小时后观察结果 【结果】 说明： （1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应 （2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应 （3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分 又有不同部分，此为部分同一性反应 单向免疫扩散法（单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion））正常人群正常人群 IgG 正常值检测正常值检测 【原理】 在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗 原浓度呈正相关同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml 或 IU/ml） 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中 IgG、IgA 及 IgM 的含量及正常值。

【材料】 1示教部分： 2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含 2NaN3） 标准马抗人 IgG 血清（抗体） （北京生物制品研究所生产） 参考蛋白工作标准（北京生物制品研究所生产） pH7.2 PBS 玻璃板或载玻片 打孔器（孔径 3mm）及打孔模板 微量加样器 湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料） 2实验部分： 已制备好的含有马抗人 IgG 抗体的 1%琼脂板 1:50 稀释的单人份待检血清标本 打孔器、模板、微量加样器及湿盒等 【方法】 （一）标准曲线的制备：示教 1按照玻片的大小，以能制做 11.5mm 厚度的琼脂板的量，分装其 1/2 量的 2%盐水琼脂例如，用普通载玻片制做时其 1%琼脂量为 4ml，在 分装 2%盐水琼脂时既为 2ml溶化后置 5660水浴中平衡温度备用 2稀释抗体：将标准抗人 IgG 抗体按其效价用 pH7.2 PBS 做成 1 倍稀释例如，血清效价为 1:140，原浓血清既应稀释为 1:70并分装试管，其 分装量应与 2%盐水琼脂量相等 3制板：将已稀释的抗人 IgG 抗体于 56水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持 5660的 2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。

翻转 试管 12 次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡） ，迅速倾注于玻片上，待凝固后既制成 4打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔 5 个，孔距 10mm 5稀释不同浓度的参考蛋白标准（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG 为 100 单位/ml，80.4 微克/ 单位，其稀释范围为 1:10、1:20、1:40、1:80 及 1:160 6加样：将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入 10l（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头） 7置湿盒中，放 37温箱，24 小时后观察结果 8用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，不同单位/ml 为横座标，绘制成标准曲线 在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板 （二）正常人血清中 IgG 值的测定： 1将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔 4 个（孔径 3mm，孔距 10mm） 2将单份正常人血清用 pH7.2 PBS 分别作 1:50 稀释 3用微量加样器分别取 1:50 稀释的单人份血清标本 10l 加入孔中，每份标本应各加两孔（每份标本均应更换塑料吸头） 。

4作好标记置湿盒中，放 37温箱，24 小时后观察结果 【结果】 测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含 IgG 的单位/ml，并换算为 mg/ml 将全班实验结果做出统计及均值，并写出较完整的实验报告 。