基因诊断3LMJ课件.ppt

第八章第八章 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗基因诊断（基因诊断（基因诊断（基因诊断（gene diagnosisgene diagnosis）：）：）：）：————从基因水平探测和分析疾病的起因从基因水平探测和分析疾病的起因基因治疗（基因治疗（基因治疗（基因治疗（gene therapygene therapy）：）：）：）：————从基因水平干涉和矫正疾病造成的紊乱从基因水平干涉和矫正疾病造成的紊乱1 多数非感染性疾病发生的根本原因是多数非感染性疾病发生的根本原因是基因结基因结基因结基因结构的变异构的变异构的变异构的变异或或表达水平的异常表达水平的异常表达水平的异常表达水平的异常；感染性疾病则是病；感染性疾病则是病原体入侵在体内原体入侵在体内表达外源性基因表达外源性基因表达外源性基因表达外源性基因所致授课老师：江黎明授课老师：江黎明2024/9/71基因诊断(3-LMJ)一、基因诊断的概念和特点一、基因诊断的概念和特点二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测四、疾病的基因诊断(自习)五五、、基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用第一节第一节 基因诊断基因诊断 (gene diagnosis)2024/9/72基因诊断(3-LMJ) 基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断通常是通常是指利用分子生物学的方法技指利用分子生物学的方法技术，直接检测体内术，直接检测体内DNADNA的的结构变异结构变异结构变异结构变异或或RNARNA的的水平变水平变水平变水平变化化化化，从而对疾病作出诊断的方法。

从而对疾病作出诊断的方法一一 、基因诊断的概念和特点、基因诊断的概念和特点（一）概念（一）概念        适用于遗传性疾病遗传性疾病、感染性疾病感染性疾病、肿瘤肿瘤等多种疾病的诊断，以及个体识别个体识别和亲子鉴定亲子鉴定等法病学领域2024/9/73基因诊断(3-LMJ)（二）特点（二）特点----以已知基因作为检测对象以已知基因作为检测对象（（l）特异性强）特异性强：直接检测导致疾病发生的基因变化；：直接检测导致疾病发生的基因变化；（（2）灵敏度高）灵敏度高：所采用的分子杂交和聚合酶链反应：所采用的分子杂交和聚合酶链反应 等技术都具有信号放大作用；等技术都具有信号放大作用；（（3）取样便利）取样便利：一般不受组织或时相的限制；：一般不受组织或时相的限制；（（4）早期诊断）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断；：易在疾病尚无临床表现时作出诊断；（（5）应用广泛）应用广泛：可检测自体基因和外源基因可检测自体基因和外源基因一一 、基因诊断的概念和特点、基因诊断的概念和特点2024/9/74基因诊断(3-LMJ)( ( ( (一一一一) ) ) )核酸分子杂交（核酸分子杂交（核酸分子杂交（核酸分子杂交（NA hybridizationNA hybridizationNA hybridizationNA hybridization）））） ( ( ( (二二二二) ) ) )聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCRPCRPCR））））技术技术技术技术( ( ( (三三三三) ) ) )单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCPSSCPSSCPSSCP）））） ( ( ( (四四四四)DNA)DNA)DNA)DNA分子多态性（分子多态性（分子多态性（分子多态性（DNA polymorphismDNA polymorphismDNA polymorphismDNA polymorphism）分析）分析）分析）分析( ( ( (五五五五) ) ) )限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLPRFLPRFLP）分析）分析）分析）分析( ( ( (六六六六) ) ) )显微切割（显微切割（显微切割（显微切割（microdissectionmicrodissectionmicrodissectionmicrodissection）技术）技术）技术）技术5( ( ( (七七七七)DNA)DNA)DNA)DNA序列测定（序列测定（序列测定（序列测定（DNA sequencingDNA sequencingDNA sequencingDNA sequencing）））） 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/75基因诊断(3-LMJ)( (一一) )核酸分子杂交核酸分子杂交4.DNA 芯片(DNA chip)技术 Southern/DNASouthern/DNA印迹印迹、Northern/RNANorthern/RNA印迹印迹 (第七/六章)和Western/Western/蛋白质印迹蛋白质印迹(第九/二章)其他杂交方法其他杂交方法其他杂交方法其他杂交方法: : : :1.斑点印迹(dot blotting)与狭缝杂交2. 组织原位杂交组织原位杂交(tissure in situ hybridization )3. 等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交 (allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH) 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/76基因诊断(3-LMJ)71.斑点印迹斑点印迹(dot blotting)杂交杂交将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性后与标记探针结合，显影或显色，密度测量，与对照品比较确定所测核酸量的高低。

方法：方法：应用：应用：主要用于检测细胞基因拷贝数的变化或者mRNA含量的变化便于大规模检测和筛选；容易出现假阳性特点：特点：2024/9/77基因诊断(3-LMJ)92.组织原位杂交组织原位杂交(tissure in situ hybridization )组织或细胞 (新鲜组织切片、细胞涂片或石蜡切片)样品做适当处理(如固定剂固定固定、蛋白酶消化消化) )，使其通透性增大，标记探针进入细胞内与核酸杂交方法：方法：应用：应用：被检测基因或mRNA在细胞内的检测及定位特点：特点：不需提取不需提取被检核酸，可确定核酸，可确定被检核酸核酸细胞内定位19861986创建的创建的荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH) (FISH) (FISH) (FISH) 用于特定基因的用于特定基因的定位及其缺失、扩增或重排的检测定位及其缺失、扩增或重排的检测2024/9/79基因诊断(3-LMJ)2024/9/710基因诊断(3-LMJ)原癌基因原癌基因ERBB-2(Her-2)，，基因扩增基因扩增荧光原位杂交检测荧光原位杂交检测2024/9/711基因诊断(3-LMJ)3.等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)根据已知基因突变位点的碱基序列突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型野生型或突变型突变型基因序列片段互补的两种探针两种探针，分别与被检DNA进行杂交，确定基因突变存在与否，分辨纯/杂合子。

方法：方法：应用：应用： 基因结构变异基因结构变异所致疾病的诊断特点：特点： 杂交条件要求严格，以避免出现假阳性或假阴性2024/9/713基因诊断(3-LMJ)N N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHMASOH示意图示意图2024/9/714基因诊断(3-LMJ)4. DNA 芯片芯片(DNA chip)技术技术DNADNA点阵点阵 (DNA array)(DNA array)——把多种已知序列的DNA片段排列在固体支持物上，同时对样品中的多种核酸进行检测和分析方法：方法：应用：应用：单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传性疾病的分析；病原微生物的大规模检测DNADNA微阵列微阵列 (DNA microarray)(DNA microarray)——通过计算机控制点样和图像扫描的高密度集成探针的杂交技术2024/9/715基因诊断(3-LMJ)(二)PCR 技术 (第七/七章)1. PCR技术的原理技术的原理 以以DNADNA分子为分子为模板模板，加入与拟扩增，加入与拟扩增DNADNA片段两片段两端分别互补的一对寡核苷酸链作为端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物引物，在，在 DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合的催化下，按照半保留复制的形式分别合成两股新的成两股新的DNADNA互补链，可使两引物间的互补链，可使两引物间的DNADNA片段片段拷贝数增加一倍。

拷贝数增加一倍 多次重复这一过程，可使这段多次重复这一过程，可使这段 DNADNA拷贝数随拷贝数随复制次数以指数形式扩增复制次数以指数形式扩增 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/716基因诊断(3-LMJ)2. 2. 基因诊断中常用的基因诊断中常用的PCRPCR及其衍生技术及其衍生技术 (1) (1) DNADNADNADNA的微量分析的微量分析 总RNA(或mRNA) ss-cDNA ds-cDNA PCR扩增 PCR法灵敏度高，对模板DNA纯度要求不高，且样品用量极微(如一滴血、一根头发等)2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)(2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)(2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)(2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)2024/9/717基因诊断(3-LMJ)18(3)(3)巢式巢式-PCR(nested PCR)-PCR(nested PCR) 用2对引物(外引物、内引物)扩增，大大提高提高了扩增的特异性了扩增的特异性(4) (4) 不对称不对称PCR(asymmetric PCR )PCR(asymmetric PCR ) 2个引物浓度不等，一般采用50:1或100:1 的摩尔比，主要获取单链获取单链DNADNA作构象分析或用作探针。

2024/9/718基因诊断(3-LMJ)19(5)(5)多重多重PCR(multiplex PCR) PCR(multiplex PCR) 在同反应体系中加入多对引物多对引物，同时扩增同一 DNA样品中的多个不同序列区域不同序列区域，且每对引物所扩增的产物长度都不同，可根据电泳结果判断是否存在某些基因片段的缺失或长度改变6)(6)等位基因特异性等位基因特异性PCR(AS-PCR) PCR(AS-PCR) 针对等位基因的序列差异区域设计引物，使引物的 3’3’端端与等位基因序列的差异碱基差异碱基对应，仅能与突变型或野生型互补2024/9/719基因诊断(3-LMJ)(7)(7)原位原位PCR (PCR (in situ in situ PCR,IS-PCR) PCR,IS-PCR) 技术技术 1)1)细胞和组织经固定剂固定、蛋白酶消化，细胞和组织经固定剂固定、蛋白酶消化，使使细胞获得适度的通透性，既利于细胞获得适度的通透性，既利于 PCRPCR反应试剂到反应试剂到达靶位，又可防止扩增产物从细胞内漏出；达靶位，又可防止扩增产物从细胞内漏出； 2)2)把载玻片的靶把载玻片的靶DNADNA进行常规进行常规PCRPCR( (病毒病毒RNARNA的扩的扩增用增用RT-PCR);RT-PCR); 3)3)最后通过间接法最后通过间接法( (原位杂交原位杂交) )或直接法或直接法(PRC(PRC过过程中加入标记程中加入标记) )检测扩增产物。

检测扩增产物2024/9/720基因诊断(3-LMJ)（（8）实时荧光定量）实时荧光定量PCR PCR扩增时，Taq酶的5’- 5’- 3’3’外外切切酶酶活活性性将探针酶切降解，使报报告告荧荧光光基基团团和淬淬灭灭荧荧光光基基团团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号； 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步2024/9/721基因诊断(3-LMJ)22( (三三) ) 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 利用利用单个或多个碱基不同单个或多个碱基不同、但序列长度相等的、但序列长度相等的双链核酸分子，经变性成单链后双链核酸分子，经变性成单链后可可具有具有不同的构象不同的构象而在中性而在中性PAGEPAGE电泳中的电泳中的迁移率不同迁移率不同；；(single strand comformation polymorphism, (single strand comformation polymorphism, (single strand comformation polymorphism, (single strand comformation polymorphism, SSCP)SSCP)SSCP)SSCP) 与正常的电泳图型对照，出现新条带即可判定与正常的电泳图型对照，出现新条带即可判定存在碱基变异。

存在碱基变异 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/722基因诊断(3-LMJ)与与与与PCRPCRPCRPCR联用称为联用称为联用称为联用称为PCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCP；广泛用于大批样品基因突变的检测；广泛用于大批样品基因突变的检测；广泛用于大批样品基因突变的检测；广泛用于大批样品基因突变的检测( ( ( (初筛初筛初筛初筛) ) ) )2024/9/723基因诊断(3-LMJ)241.1.限制性片段长度多态性的检测限制性片段长度多态性的检测3.3.单核苷酸多态性单核苷酸多态性2.2.数目可变的数目可变的串联重复序列多态性的检测串联重复序列多态性的检测( (四四)DNA)DNA分子多态性分子多态性 (DNA polymorphism )(DNA polymorphism )分析分析分析分析(single nucleotide polymorphism, SNPSNP )(variable number of tandem repeatstandem repeats, VNTRVNTR)(restriction fragment length polymorphism, RFLP RFLP ) 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/724基因诊断(3-LMJ)25VNTRVNTR的的重复序列出现次数在重复序列出现次数在6 6次次100100次之间；次之间；•小卫星小卫星DNADNA(minisatellite DNA):(minisatellite DNA):重复单元长度重复单元长度为为6 6~70bp70bp；；•微卫星微卫星DNADNA(microsatellite DNA ):(microsatellite DNA ):重复单元长重复单元长度为度为1 1~6bp6bp。

•短串联重复短串联重复DNADNA(short tandem repeat DNA,STR (short tandem repeat DNA,STR DNA):DNA):重复单元长度为重复单元长度为2 2~6bp6bp根据重复单元长度可分为：根据重复单元长度可分为：根据重复单元长度可分为：根据重复单元长度可分为：2024/9/725基因诊断(3-LMJ)26 不同个体间重复单元不同个体间重复单元 [ [如如(CA)n/(TG)n](CA)n/(TG)n]的拷贝的拷贝数数 ( (即出现的频率即出现的频率) ) 不同，因而产生多态性，称为不同，因而产生多态性，称为VNTRVNTR多态性VNTRVNTR多态性：多态性：限制酶识别位点限制酶识别位点 限制酶识别位点限制酶识别位点 2024/9/726基因诊断(3-LMJ)27( (五五) ) 限制酶谱分析限制酶谱分析 当某种限制酶的切点切点改变时(由点突变、单个碱基的插入或缺失引起)，用该种限制酶切割后得到的DNA片段的大小大小和数目数目都随之发生变化，通过电泳分析即可作出判断。

PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在 PCR扩增后用该限制酶切割 PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/727基因诊断(3-LMJ)ABCDEFG－－＋＋DEFBGCA-GAATTC--CTTAAG-EFBG－－ ＋＋C +DAEcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化2024/9/728基因诊断(3-LMJ)29( (六六) )显微切割显微切割(microdissection)(microdissection)技术技术 是应用是应用激光捕获显微镜激光捕获显微镜，在高倍镜下选择，在高倍镜下选择几几个甚至一个细胞个甚至一个细胞进行分析；可用于石蜡包埋组织进行分析；可用于石蜡包埋组织进行回顾性诊断进行回顾性诊断2.2.2.2.染色体的显微切割染色体的显微切割染色体的显微切割染色体的显微切割1.1.1.1.组织细胞的显微切割组织细胞的显微切割组织细胞的显微切割组织细胞的显微切割 是切割是切割分裂中期的染色体分裂中期的染色体的目的区域，如某的目的区域，如某些断裂或易位、倒位位点的染色体片段，再进行些断裂或易位、倒位位点的染色体片段，再进行后续分析。

后续分析 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/729基因诊断(3-LMJ) 瑞士瑞士 MII CellCut MII CellCut 全自动激光显微切割（荧光）系统全自动激光显微切割（荧光）系统 可通过紫外激光紫外激光切割需要分离的组织，然后通过有黏性的有黏性的EppendorffEppendorff管盖管盖进行收集，这样就可以将特定类型的细胞从组织切片上分离下来2024/9/730基因诊断(3-LMJ) 可可以以准准确确、、快快速速、、无无损损伤伤地地分分离离出出纯纯净净的的特特定定细细胞胞或或组组织织，，保保持持细细胞胞内内生生物物分分子子的的完完整整性性，，以以便便用用于于后后续续的的DNADNA、、RNARNA和和蛋蛋白质分析白质分析 配配有有近近红红外外激激光光( (波波长长810nm)810nm)；；紫紫外外激激光光( (波波长长349nm)349nm)；；红红色色、、绿绿色色、、蓝蓝色色三三种荧光滤光片种荧光滤光片美国美国Arcturus公司的公司的VeritasVeritas激光捕获显微分离仪激光捕获显微分离仪2024/9/731基因诊断(3-LMJ)PICS Altra II流式细胞仪(分析分选)2024/9/732基因诊断(3-LMJ)33( (七七)DNA)DNA序列测定序列测定 该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最可靠的可靠的——种。

缺点：费时、费力、种缺点：费时、费力、费用高费用高 二、基因诊断的主要技术方法二、基因诊断的主要技术方法2024/9/733基因诊断(3-LMJ)34( ( ( (一一一一) ) ) )点突变的检测点突变的检测点突变的检测点突变的检测三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测( ( ( (二二二二) ) ) )大片段核苷酸丢失或插入的检测大片段核苷酸丢失或插入的检测大片段核苷酸丢失或插入的检测大片段核苷酸丢失或插入的检测( ( ( (三三三三) ) ) )基因重排的检测基因重排的检测基因重排的检测基因重排的检测( ( ( (四四四四) ) ) )基因扩增的检测基因扩增的检测基因扩增的检测基因扩增的检测( ( ( (五五五五)DNA)DNA)DNA)DNA多态性的检测多态性的检测多态性的检测多态性的检测 ( ( ( (六六六六) ) ) )基因表达异常的检测基因表达异常的检测基因表达异常的检测基因表达异常的检测( ( ( (七七七七) ) ) )病原体基因的检测病原体基因的检测病原体基因的检测病原体基因的检测 2024/9/734基因诊断(3-LMJ)35( (一一) )点突变的检测点突变的检测 狭义的点突变指碱基替代，分为单点突变和狭义的点突变指碱基替代，分为单点突变和多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺失或插入。

失或插入 1.1.已知点突变的检测已知点突变的检测 突变位点已被阐明的遗传病，可采用PCRPCRPCRPCR等等等等位基因特异性寡核苷酸杂交位基因特异性寡核苷酸杂交位基因特异性寡核苷酸杂交位基因特异性寡核苷酸杂交(PCR/AS0H)(PCR/AS0H)(PCR/AS0H)(PCR/AS0H)检测三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测2024/9/735基因诊断(3-LMJ)PCR/AS0HPCR/AS0HPCR/AS0HPCR/AS0H 检测检测: : (1) (1)根据突变点上下游的序列设计合成引物，根据突变点上下游的序列设计合成引物，PCR PCR 扩增出扩增出突变区的突变区的DNADNA片段 (2) (2) (2) (2) 将将将将PCRPCRPCRPCR产物用斑点或狭缝点样器点在尼龙膜上，以产物用斑点或狭缝点样器点在尼龙膜上，以产物用斑点或狭缝点样器点在尼龙膜上，以产物用斑点或狭缝点样器点在尼龙膜上，以紫外线照射固定紫外线照射固定紫外线照射固定紫外线照射固定 (3) (3) (3) (3) 针对上述每种突变位点，分别合成针对上述每种突变位点，分别合成针对上述每种突变位点，分别合成针对上述每种突变位点，分别合成 2 2 2 2个寡核苷酸探个寡核苷酸探个寡核苷酸探个寡核苷酸探针；其中一个具有正常的碱基序列，另一个则具有突变的针；其中一个具有正常的碱基序列，另一个则具有突变的针；其中一个具有正常的碱基序列，另一个则具有突变的针；其中一个具有正常的碱基序列，另一个则具有突变的碱基序列。

碱基序列碱基序列碱基序列 (4) (4) (4) (4)分别预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色分别预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色分别预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色分别预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色 (5) (5) (5) (5) 分析正常探针及突变探针分别杂交得到的显影或显分析正常探针及突变探针分别杂交得到的显影或显分析正常探针及突变探针分别杂交得到的显影或显分析正常探针及突变探针分别杂交得到的显影或显色图谱，即可作出基因诊断色图谱，即可作出基因诊断色图谱，即可作出基因诊断色图谱，即可作出基因诊断2024/9/736基因诊断(3-LMJ)N N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM(PCR/AS0H (PCR/AS0H (PCR/AS0H (PCR/AS0H 检测示意图检测示意图) )2024/9/737基因诊断(3-LMJ)2.2.未知点突变的检测未知点突变的检测初筛：初筛：PCR-SSCP分析法分析法确认：确认：DNA  sequencing2024/9/738基因诊断(3-LMJ)PCR-SSCP: PCR-SSCP: PCR-SSCP: PCR-SSCP: 广泛用于大批样品基因突变的检测广泛用于大批样品基因突变的检测广泛用于大批样品基因突变的检测广泛用于大批样品基因突变的检测( ( ( (初筛初筛初筛初筛) ) ) )。

2024/9/739基因诊断(3-LMJ)3. 3. 少数核苷酸缺失或插入的检测少数核苷酸缺失或插入的检测 可供选择的方法：可供选择的方法：PCR-RFLP分析分析、、AS-PCR、PCR-SSCP及及DNA测序等测序等2024/9/740基因诊断(3-LMJ)镰形细胞贫血镰形细胞贫血•原因：原因：β-珠蛋白链第珠蛋白链第 6位密码子位密码子GAG→GTG，造，造 成成Glu→Val所致•方法：设计一对引物方法：设计一对引物PCR扩增可得扩增可得294bp，，Oxa NI 消化，电泳消化，电泳294191103bpA  A：正常人BB：纯合子病人CC：杂合子病人•结果：结果：2024/9/741基因诊断(3-LMJ)(二二) 大片段核苷酸丢失或插入的检测大片段核苷酸丢失或插入的检测 1. 中等长度中等长度中等长度中等长度 (0.5-1.5kb) (0.5-1.5kb) 的的的的DNADNA片段缺失或插入，片段缺失或插入，片段缺失或插入，片段缺失或插入，可用一对引物的普通可用一对引物的普通可用一对引物的普通可用一对引物的普通PCRPCR检测。

检测 2. 若若若若基因较大基因较大基因较大基因较大度度度度 ( (大于大于大于大于1.5kb) 1.5kb) ，且，且，且，且多个位点多个位点多个位点多个位点 存在存在存在存在插入或缺失插入或缺失插入或缺失插入或缺失、、、、位点间距离较远位点间距离较远位点间距离较远位点间距离较远，宜采用多重，宜采用多重，宜采用多重，宜采用多重PCRPCR法法法法检测检测检测检测5’ 3’3’ 5’（（多重多重PCR的引物设计示意图的引物设计示意图））三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测2024/9/742基因诊断(3-LMJ) DMD DMD基因定位于人类基因定位于人类 X X染色体短臂染色体短臂 Xp21.2Xp21.2上位于该区的位于该区的dystrophin(dystrophin(dystrophin(dystrophin(肌营养不良蛋白肌营养不良蛋白肌营养不良蛋白肌营养不良蛋白) ) ) )基因基因的的突变或部分缺失，是导致突变或部分缺失，是导致DMDDMD的原发病因。

的原发病因 dystrophindystrophindystrophindystrophin基因中有基因中有基因中有基因中有9 9个易发生缺失的热点区个易发生缺失的热点区片段片段, ,它们分别位于外显子它们分别位于外显子4 4、、8 8、、1212、、1717、、1919、、4444、、4545、、4848和和5151杜氏肌营养不良症杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)2024/9/743基因诊断(3-LMJ)多重多重PCR法检测中的基因突变法检测中的基因突变 同时用同时用2 2 2 2对引物对引物对引物对引物双重扩增双重扩增dystrophindystrophindystrophindystrophin基因基因基因基因外外显子显子1717和和4848区域内的区域内的2 2个片段，可检测出个片段，可检测出7575％左％左右的基因缺失型患者；右的基因缺失型患者； 若同时用若同时用9 9对引物多重对引物多重扩增，则可以检测到扩增，则可以检测到9090％左右的基因缺失型患者％左右的基因缺失型患者。

2024/9/744基因诊断(3-LMJ)( (三三) ) 基因重排的检测基因重排的检测 基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置称基因易位或重排体的某个位置称基因易位或重排1.1.荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH) (FISH) 2.PCR2.PCR扩增扩增 可用可用不同颜色的荧光标记不同颜色的荧光标记不同颜色的荧光标记不同颜色的荧光标记DNADNADNADNA探针探针探针探针，可在染色，可在染色体上定位基因或体上定位基因或DNADNA片段及它们彼此间的排序片段及它们彼此间的排序 前提条件是已知重排基因和位点的序列前提条件是已知重排基因和位点的序列三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测2024/9/745基因诊断(3-LMJ)荧光原位杂交荧光原位杂交（双色FISH）2024/9/746基因诊断(3-LMJ)( (四四) ) 基因扩增的检测基因扩增的检测 基因扩增指基因拷贝数增加的现象基因扩增指基因拷贝数增加的现象, ,可可增加几十到上千倍。

增加几十到上千倍 可用待测基因的可用待测基因的 DNADNA片段或片段或cDNAcDNA片段为片段为探针，基因组探针，基因组DNA DNA 采用采用适当的限制酶酶切适当的限制酶酶切后后作作SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交分析三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测2024/9/747基因诊断(3-LMJ)        ( (五五)DNA)DNA多态性的检测多态性的检测 1 1.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLP)(RFLP)2.2.数目可变串联重复序列数目可变串联重复序列(VNTR)(VNTR)多性多性 多态性位点周围DNA序列已知时，可用PCR/ RFLP分析 针对串联重复序列两侧的DNA序列设计引物，PCR 扩增后电泳三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测2024/9/748基因诊断(3-LMJ)1 1 .mRNA mRNA 的相对定量分析的相对定量分析 (1) (1) (1) (1) 斑点杂交或狭线杂交斑点杂交或狭线杂交斑点杂交或狭线杂交斑点杂交或狭线杂交 放射或非放射标记的放射或非放射标记的cDNAcDNA探针与待测探针与待测RNARNA杂交，杂交，经显影或显色，与正常对照比较即可定量待测经显影或显色，与正常对照比较即可定量待测RNARNA。

(2) RT-PCR (2) RT-PCR (2) RT-PCR (2) RT-PCR 法法法法 对电泳凝胶中的扩增产物对电泳凝胶中的扩增产物cDNAcDNA行光密度扫描，行光密度扫描，计算模板计算模板mRNAmRNA的量；若的量；若dNTPs dNTPs 带放射性标记，作带放射性标记，作放射活性测定，并由此推算放射活性测定，并由此推算mRNAmRNA的含量 (六六) )基因表达异常的检测基因表达异常的检测三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测2024/9/749基因诊断(3-LMJ)2.mRNA2.mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 (1)(1)采用一系列已知不同浓度的与待测采用一系列已知不同浓度的与待测mRNAmRNA序列相同序列相同但长度不同的内对照但长度不同的内对照mRNAmRNA，在同一体系中一同进行，在同一体系中一同进行RT-RT-PCR(PCR(加加3232p p-dCTP)dCTP)，扩增产物经电泳分离，分别测定两者扩增产物经电泳分离，分别测定两者放射性强度，绘制标准曲线即可查出特异放射性强度，绘制标准曲线即可查出特异mRNAmRNA的量。

的量 (2) (2)用荧光定量用荧光定量用荧光定量用荧光定量PCRPCRPCRPCR法对扩增产物定量法对扩增产物定量法对扩增产物定量法对扩增产物定量3.mRNA3.mRNA的长度分析的长度分析 (2) (2)先分析先分析RT-PCRRT-PCR产物电泳条带长度，后产物电泳条带长度，后测序测序确认 (1) (1)采用采用NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交法检测某种特异的法检测某种特异的mRNAmRNA的长的长度有否改变；度有否改变； 2024/9/750基因诊断(3-LMJ)( ( ( (一一一一) ) ) )遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断1.1.1.1.血红蛋白病（血红蛋白病（血红蛋白病（血红蛋白病（hemoglobinopathyhemoglobinopathyhemoglobinopathyhemoglobinopathy）））） 四四、、疾病的基因诊断疾病的基因诊断( (自习自习) )2.2.2.2.苯丙酮尿症苯丙酮尿症苯丙酮尿症苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)(phenylketonuria,PKU)(phenylketonuria,PKU)(phenylketonuria,PKU)( ( ( (二二二二) ) ) ) 感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断1.1.1.1.乙型肝炎的基因诊断乙型肝炎的基因诊断乙型肝炎的基因诊断乙型肝炎的基因诊断2.2.2.2.痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的检测痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的检测痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的检测痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的检测( ( ( (三三三三) ) ) ) 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断1.1.1.1.肺癌肺癌肺癌肺癌(lung cancer)(lung cancer)(lung cancer)(lung cancer)2.2.2.2.乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌(breast cancer)(breast cancer)(breast cancer)(breast cancer)2024/9/751基因诊断(3-LMJ)( (一一) )重复序列多态性与重复序列多态性与DNADNA指纹指纹 人类基因组人类基因组DNADNA序列中存在众多的多态遗传标序列中存在众多的多态遗传标记，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的记，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的DNADNA分分析图谱会完全相同，称为析图谱会完全相同，称为DNADNA指纹。

指纹五五、、基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用 人类基因组中存在有大量的人类基因组中存在有大量的数目可变的串联重复数目可变的串联重复数目可变的串联重复数目可变的串联重复序列序列序列序列(VNTR)(VNTR)(VNTR)(VNTR)；可分为小卫星；可分为小卫星 DNADNA、微卫星、微卫星DNA/DNA/短串联短串联重复重复(STR) (STR) VNTR VNTR位点的平均杂合度在位点的平均杂合度在70% 70% 左右，存在极为广泛，左右，存在极为广泛，分布十分理想，且检测方法简便，以取代分布十分理想，且检测方法简便，以取代RFLPRFLP而成为构建而成为构建连锁图谱的新标记连锁图谱的新标记2024/9/752基因诊断(3-LMJ) 19851985年年，，英英国国遗遗传传学学家家JeffreysJeffreys等等用用串串联联重重复复序序列列(TR)(TR)的的核核心心序序列列为为探探针针进进行行RFLPRFLP分分析析，，检检测测到到许许多多高高度度可可变变区区(HVR)(HVR)，，所所得得图图谱谱具具有有高高度度的的个个体体特特异异性性，，达达到到了了如如同同人人类类指指纹纹那那样样的的高高度度专专一一性性，，称称 为为 DNADNA指指 纹纹 图图 谱谱 ( (DNA DNA fingerprinting)fingerprinting)。

Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 2024/9/753基因诊断(3-LMJ)( (二二) DNA) DNA指纹与法医案检工作指纹与法医案检工作 法法医医学学中中基基因因诊诊断断的的目目的的主主要要是是个个体体识识别别和和亲子鉴定亲子鉴定 以以往往法法医医学学鉴鉴定定中中应应用用的的是是血血型型、、血血清清蛋蛋白白型型、、红红细细胞胞酶酶型型和和HLAHLA分分型型、、单单位位点点特特异异性性探探针针RFLPRFLP分分析析；；个个体体分分辨辨力力不不够够，，只只能能排排除除，，不不能做到统一认证能做到统一认证五五、、基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用2024/9/754基因诊断(3-LMJ)法医案检中的基因诊断技术法医案检中的基因诊断技术•VNTR（可变数目串联重复序列（可变数目串联重复序列/小卫星）的小卫星）的核核酸分子杂交酸分子杂交分析分析•STR（短串联重复序列（短串联重复序列/微卫星）的微卫星）的PCR分析分析•SNP的的基因芯片检测基因芯片检测2024/9/755基因诊断(3-LMJ)亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。

为养女 2024/9/756基因诊断(3-LMJ)血迹中的血迹中的DNA2024/9/757基因诊断(3-LMJ)。