基因克隆的技术.docx

摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或 DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗 传性状的目的本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术： 目的基 因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子ABSTRACT : Gene cloning tech no logy is the core of molecular biology tech no logy, its purpose is obta in a gene or DNA fragme nts of the copy, used for in-depth an alysis the structure and fun cti on of gen es, and may achieve huma n cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the follow ing several aspectsto in troduce gene cloning tech no logy: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification.Keywords： purpose gen e;restrict ion endonu clease;cl on e;restructuri ng molecules基因克隆是 70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术， 可概括为：分、 切、连、转、选。

分”是指分离制备合格的待操作的 DNA 包括作为运载体的 DNAffi欲克隆的目的DNA “切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体 DNA 或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形 成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细 胞中 进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组 DNA分子的个体基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体 DNA在体 外人工连接，构建成新的重组DNA然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和 状态的转移和重新组合1. 目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因， 也就是将要克隆或表达的基因获得 目的基因是分子克隆过程中最重要的一步 基因工程流程的第一步就是获得目的 DNZ片段，所需目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基 因 常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNAfc及建立基因文库的方法来筛选⑴1.1 PCR 方法1.1.1 PCRPCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA聚合酶链式反应（PCR是体外酶促 合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反 应组成一个周期，循环进行，使目的DNA#以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操 作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可 用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA勺地方•聚合酶链式 反应（Polymerase Cha in Reaction，简称PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增 技术DNA勺半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链DNA在多种酶的作用 下 可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制 成同样的两分子挎贝在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降 低后又可以复性成为双链因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物 做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制匕］PCF由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA勺变性： 模板DNA经加热至94C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形 成的双 链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40〜60C左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸： DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP为反应原料，靶序列为 模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制 链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制 链”，而且这种新 链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2〜4分钟， 2〜 3小时就能将待扩目的 基因扩增放大几百万倍 ⑷1.1.2 RT-PCR反转录PCR （ RT-PCR又称为逆转录PCR是将RNA的逆转录（RT和cDNA的 聚合酶链式扩增反应（PCR相结合的技术其原理是：提取组织或细胞中的总RNA以 其中的mRN作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转 录成cDNA再 以cDNA为模板进行PCRT增，而获得目的基因或检测基因表达是将RNA的逆转录 （RT和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR相结合的技术⑷RT-PCR技术灵敏而且 用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列等1.1.3 real — time PCR实时荧光定量PC技术于1996年由美国applied biosystems公司推出，由于 该技 术不仅实现了 PC从定性到定量的飞跃，而且与常规的PCR目比，它具有特异性更强， 灵敏度高，重复性好，定量准，等优点，目前已得到广泛应用 ⑸所谓实时荧光定量PC技术，是指在PC反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时 监测整个PC进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量 PC技术不仅广泛地应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段 应用于兽医临床其应用涉及到的范围包括病原体的检测、基因表达的定量和等位基因 的鉴定等多个领域⑹实时定量PC反应是在带透明盖的塑料小管中，激发光可以直接透过管盖，使其 中的荧光探针被激发荧光探针事先混合在PC反应液中，只有与DNAS合后，才能 够被激发发出荧光随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DN上的荧光探针，即 被激发产生的荧光相应增加⑶Wo等⑴］利用SYBR Green I作为荧光染料建立了一 种鉴定钩端螺旋体的方法，利用熔点曲线分析来区别特异产物、引物二聚体和非特异性 产物，不需要电泳来鉴定，该方法快速而敏感，整个过程在 20 min 内完成 Jamest 51 等应用TaqMa探针建立了从小牛腹泻粪便中定量检测水源性 寄生虫小隐抱子虫的C j 基因和18S rRNA勺方法Frank等上］建立了基于TaqMan探针的实时RT-PC方法, 从感染马传染性贫血病毒(EIAV)的马血浆中定量检测EIAV的荷裁量，比竞争性RT-PC 更省事，有更大的检测范围1.2基因组文库或cDNA文库的构建和筛选将基因组DNA用限制性内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段 的克隆载体，这种克隆载体的混合物含有长短不同的基因组片段， 这就是基因文库。

若将细胞内所有mRN购逆转录成cDNA然后将所有cDNA片段克隆到 适当 的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，这就是cDNA文库cDNA 的合成可用RT - PCR法，也称反转录PCR］它是一种酶促合成法，即以mRN为模 板,在反转录酶的作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cD NA),再经复制后即 成双链DNA从真核生物中提取mRNA，由于mRNAf有100- 200 bp的Poly(A),用与 Poly(A)互补的12-18个核苷酸的Oligo (dT)合成的一种组织中所有mRNA对应的cDNA 第一链然后使用末端转移酶在cDNA第一链末端加上多聚C,经变性和水解mRNAf, 加入1个末端为多聚G的引物合成 其互补链(第二条链)，再经PCR进行大量扩增 因为真核生物的基因由编码的外显子和大量不编码的内含子两种序列组成，用这种方法得到的基因没有内 含子， 不具有启动子和终止子，所以缺乏功能活性如果外接一段调节序列， 就能在受体细 胞中表达，所以此法是克隆真核生物基因的有效方法 ⑺自从1970年Temin等发现 反转录酶以来，此法已广泛应用于人⑹、猪、田鼠、鸭子。

当获得了基因组文库或cDNA 文库，可以根据已知的信息合成特异性探针，采用核酸分子杂交的方法从文库中筛选感 兴趣的基因片段， 这仍是目前获得新基因的一种常用手段1.3 化学合成法制备基因片段采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目 的基因化学合成法可以改变原始的基因序列， 甚至可以合成自然界不存在 的序列 在合成过程中可以根据需要改变核苷酸的密码子，如将真核基因序列中不易在E. coli 中利用的稀有密码子改成 E. coli 偏爱的密码子，有利于真核基 因在 E. coli 中的表达2. 重组质粒的构建DNA体外重组是将目的基因在DNA1接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以 便下一步转化之用这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA简称 重组体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系 统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接DNA1接酶有两种：T4噬菌体DNA1接酶和大肠杆菌DNA连接酶两种DNA连 接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA 连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双 链DNA分 子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低， 一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率T4噬 菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅因子ATP 形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟 基切口的 DNA上，使DNA泉苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来连接反应通 常将两个不同大小的片断相连[10] o很多DNA聚合酶在进行PCRT增时会在PCF产物双链DNA每条链的3'端加 上 一个突出的碱基Ao pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3'端带有 一个突出的To这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCF产物的两端进行正确的AT配 对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片 断的重组载体连接反应的温度在37£时有利于连接酶的活性但是在这个温度下粘末端的氢 键结合是不稳定的因此采取折中的温度，即12〜16C，连接12〜16h （过 夜），这 样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定3. 重组分子的扩增和鉴定3.1重组DNA分子导入受体细胞目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能 进行增殖和（或）表达。

接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞受体细 胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞）原 核细胞可作为基因复制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；而真核细胞一般只用作 基因表达系统受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求： ①容 易。