蛋白质浓度的测定.doc

 实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法 目的规定  学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和措施 实验原理  考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是运用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的迅速、敏捷的措施 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范畴内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸取由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸取的增长量可知与其结合蛋白质的量 蛋白质和染料结合是一种不久的过程，约2min即可反映完全，呈现最大光吸取，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时敏捷度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸取值的变化，比Lowry法敏捷4倍，测定范畴为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范畴是1－10µg蛋白质此反映反复性好，精确度高，线性关系好。

原则曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料自身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断减少，但直线弯曲限度很轻，不影响测定 此措施干扰物少，研究表白：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰强碱缓冲液在测定中有某些颜色干扰，这可以用合适的缓冲液对照扣除其影响Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用合适的缓冲液对照很容易除掉但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除  试剂与器材 一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤最后试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇 二、原则和待测蛋白质溶液1．原则蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液2．未知蛋白质溶液 三、器材试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－型分光光度计。

  操作措施 一、原则法制定原则曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作绘制原则曲线：以A595nm为纵坐标，原则蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制原则曲线 表a试管编号01234561mg/ml原则蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm　　　　　 　　 二、微量法制定原则曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作绘制原则曲线：以A595nm为纵坐标，原则蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制原则曲线表b试管编号0123451mg/ml原则蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm　　　　　　　 三、未知样品蛋白质浓度测定测定措施同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在原则曲线的直线范畴内。

根据所测定的A595nm值，在原则曲线上查出其相称于原则蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）  注意事项 （1） （1） 如果测定规定很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸取，由于在这段时间内颜色是最稳定的2） （2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽视的测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净  思考题： 根据下列所给的条件和规定，选择一种或几种常用蛋白质定量措施测定蛋白质的浓度：（1） （1） 样品不易溶解，但规定成果较精确2） （2） 规定在半天内测定60个样品3） 规定很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度实验三、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度目的规定1、学会蛋白质含量的测定措施2、掌握该测定措施的基本原理和优缺陷原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白浓度，是运用蛋白质一染料结合的原理考马斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸取由465nm变成595nm在一定蛋白质浓度范畴内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)，因此可以通过测定染料在595nm处光吸取的增长量得到与其结合的蛋白质量。

蛋白质和染料结合是一种不久的过程，约2 min即可反映完全，呈现最大光吸取，并可稳定1 h左右，因此测定过程迅速，且不需要严格的时间控制蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时敏捷度很高，在测定溶液中含蛋白质5mg/mL时就有0.275光吸取值的变化，比Lowry法敏捷4倍，测定范畴为10-100mg蛋白质，微量测定法测定范畴是1-10mg蛋白质此反映反复性好，精确度高，线性关系好原则曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料自身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断减少，但直线弯曲限度很轻，不影响测定此措施干扰物少，研究表白:NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定强碱性缓冲剂在测定中有某些颜色干扰，可以通过合适的缓冲液对照扣除其影响Tris、乙酸、a-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用合适的缓冲液对照很容易除掉但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除由于该法简朴、迅速、干扰物质少、敏捷度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定试剂和器材1试剂(1)原则蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白=6.6测定蛋白质含量，再用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL，0.1 mg/mL蛋白溶液。

2)考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤最后试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸2.待测样品未知蛋白质溶液，规定蛋白浓度范畴为0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液合适稀释3．器材(1)722型分光光度计(2)微量进样器(3)移液管(0.1 mL及5 mL)(4)试管及试管架3．操作措施1．原则法制作原则曲线取14支试管，分两组按下表平行操作试管编号0123456原则蛋白含量(mg)01020304050601 mg/mL原则蛋白溶液(mL)00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl (mL)0.100.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂(mL)5 mL摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，原则蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制原则曲线2．微量法制作原则曲线取12支试管，分两组按下表平行操作。

试管篇号012345原则蛋白含量(mg)0135790.1 mg/mL原则蛋白溶液(mL)00.010.030.050.070.090.15 mol/L NaCl(mL)0.100.090.070.050.030.01考马斯亮蓝试剂(mL)1 mL摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595 nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，原则蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制原则曲线3．未知样品蛋白质浓度的测定测定措施同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在原则曲线的直线范畴内，根据所测定的OD595nm值，在原则曲线上查出其相称于原则蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)4．注意事项（1）如果测定规定很严格，可以再试剂加入后的5-20 min内测定光吸取，由于再这段时间内颜色最稳定2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽视测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净思考题1. 请详究考马斯亮蓝与蛋白质的呈色原理如何进行蛋白质的定量测定2. 采用该法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定成果有干扰？作为原则蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何规定。

3. 使用分光光度计时，比色皿对所测样品的成果有无影响，该如何解决？1.常规染色脱色措施：  a.电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，保证染色液可以充足覆盖凝胶 b.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间   注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜合适延长凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以合适缩短一般染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以觉得已染色充足染色2-4个小时或更长时间不会对最后的染色效果产生负面影响  c.倒出染色液染色液可以回收反复使用至少2-3次  d.加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，保证脱色液可以充足覆盖凝胶   注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果但愿自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水也可以使用其他合适的脱色液  e.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上所有被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期一般蛋白条带在脱色1-2小时后即可浮现   注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。

脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅  f.完毕脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等保存在水中的凝胶会发生溶涨如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中长期保存可以制备干胶 2.迅速染色脱色措施：  。