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Zn2+对大肠杆菌蛋白表达的影响摘要：随着社会的发展，环境污染越来越严重现在，人们已经把它提升到了一个重要 的高度环境污染包括许多方面，其中很重要的一项就是重金属盐的污染本文中重点 介绍了不同浓度重金属盐离子（Zn2+ ）对大肠杆菌的影响，以及对大肠杆菌蛋白表达的 影响希望可以通过研究它对大肠杆菌的影响，大致了解其对自然环境中各种生物的影 响关键词：大肠杆菌；Zn2+浓度；蛋白表达；电泳；灰度扫描；色谱分析1 引言随着人类社会的进步与发展，人类的活动空间逐渐增大，对环境的影响也越来越大， 环境就随着人类活动的增加而逐渐的衰退目前，环境污染已经是一个很重要的话题， 当然，它也包括很多方面，例如，空气污染、水资源污染、噪音污染、土地污染等污 染源也是方方面面的，如我们都知道的气体（主要是 H S、SO 、NO、NO 、CO 等）污染、 2 2 2 农药化肥污染以及粉尘飞沫污染等等然而，还有一项比较重要的污染一直被大家给忽 略了，那就是重金属污染目前，对于重金属污染的研究比较少，这方面的研究成果也都不太完善现在，在 国外有些实验室已经致力于这方面的研究，国内的现状却令人担忧本项目就是在此基 础上随之而生的。

本项目选用了经济实用的锌离子来进行这次实验，它具有性质简单、容易得到、结 果容易分析等特性，【1】这些使本次实验变得简单易行本项目中所有的实验都是研究重 金属盐离子（Zn2+）对生物生长的影响，重点研究的是微生物（大肠杆菌）的生长通 过不同浓度的Zn2+的对比试验，我们可以直观的发现微生物生长的变化，得到Zn2+对其 生长的影响自然界是相通的，我希望大家可以通过重金属对微生物的影响，大致了解 其对其他物种的作用2 环境变化对生物的生长影响的理论2.1 蛋白质的不稳定性生物体中的大分子物质有很多种，其中最为重要的就是核酸和蛋白质，生物的生长 发育都离不开它们，本文中重点介绍的是蛋白质蛋白质大多都不稳定，很多不适宜的 条件（如高温、强酸、强碱等）都会引起它们的形状与功能发生变化，直接影响生物体 的正常生长，导致很严重的后果蛋白质的这种不稳定性被称之为变性，它是指天然蛋白质受物理或化学因素的影 响，分子内部原有的高度规则性的空间排列发生了变化，致使其原有的性质与功能部分 或全部丧失的作用当然，蛋白质的变性不是单向的，在一定程度上它是双向的，也就是说蛋白质的变 性如果不超过一定限度，经适当处理后，可以重新变为天然蛋白质。

例如，血红蛋白经 酸变性后加碱中和可恢复其原有性状的 2/3；经水杨酸钠变性后，如果水杨酸钠的浓度 不大，将水杨酸离子除去后，血红蛋白的天然性质可以全部恢复胰蛋白酶在酸性溶液 中经70〜100C短时间热变性后，如果适当冷却，仍可以恢复其原有性质虽然这些例 子都证明蛋白质的变性为可逆的，但卵蛋白经酸变性后，即使再将酸中和亦不能恢复性 状，鸡蛋的蛋白热变性后也同样不可逆总而言之，变性的可不可逆与导致因素、蛋白 质种类和蛋白质分子结构的改变程度等都有关系2】在这众多的不适宜条件中，尤为重要的就是重金属盐离子在碱性溶液中，蛋白质 带负电荷，可以与重金属离子如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+等作用，产生重金属蛋 白盐沉淀，如铅盐及汞盐在氢氧化钠溶液中皆可使蛋白质沉淀铅中毒或汞中毒时服用 蛋白质解毒正是这种原理已经沉淀了的蛋白质不再具有其原有的结构与功能，也就是 说这个已经变性的蛋白质是一个废旧的物质，再也无法正常的实施其作用与功能，机体 就会主观的判定它是无用的，将其降解成它的组成部分——氨基酸显然，变性的蛋白 质无法正常的实施它的生理生化功能，那么这部分的化学反应就会受到影响，细胞首当 其冲，机体自然难以幸免。

2.2 生物的逆境生理逆境是指对生物生长和发育不利的各种环境因素的总称，又简称为胁迫逆境的种 类是多样的，根据环境的种类，逆境又分为生物逆境与非生物逆境，这些因素之间相互 交替，共同作用3】生物对逆境的适应能力叫做生物的适应性生物对逆境的适应方式也是多种多样 的， 如避逆性与抗逆性等其中，避逆性是指生物整个生长发育过程不与逆境接触， 而是在逆境到来之前就结束自己的生活史抗逆性是指生物对逆境的抵抗能力或耐受能 力，包括御逆性与耐逆性等等自然界的生物总是处于一个较稳定的环境内，当环境发生变化时，自身也会产生一 些变化，使自己适应新的环境但是，当环境的变化超出生物的适应范围时，就会对它 产生重要的影响，甚至使它失去生命活力，结束其生命历程2.3 重金属盐离子的定义在日常生活中，我们常把一些密度较高，俗话说比较重的金属称之为重金属（如Mn、Zn、Cu、Fe等），物理学界把密度高于4.5g/cm3的金属定义为重金属显然，含 有重金属的盐类就是大名鼎鼎的重金属盐，重金属盐在液体环境中多以离子形式存在， 这就是重金属盐离子本次实验就是基于这一理论展开的，通过不同浓度的对比试验、 SD 分光、电泳、灰度扫描、以及色谱分析等手段，得到Zn2+对微生物生长的影响。

3 材料与方法3.1 菌株大肠杆菌pop2136 （C600衍生株，含C1857基因,编码温度敏感的阻遏蛋白）3.2 试剂1. 凝胶储备液（Acr/Bis）2. 分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl,pH8.8）3. 浓缩胶缓冲液（ 0.5mol/LTris-HCl,pH6.8）4. 质量分数为10%十二烷基硫酸钠（SDS）5. 样品缓冲液（2倍还原缓冲液）6. 电极缓冲液7. 标准蛋白质溶液8. 质量分数为 10%过硫酸铵9.质量分数为 1.5%琼脂10. 染色液11. 脱色液12. 待测相对分子质量的样品3.3 仪器1. 高压灭菌锅2. 干燥鼓风机3. 恒温培养箱4. 超净工作台5. 摇床培养箱6. UV-9100 型紫外可见分光光度计7. 直流稳压电泳仪8. 垂直平板电泳槽9. 烧杯、试管、滴管、直尺、移液管、涂布环、容量瓶、试剂瓶、培养皿等4 实验步骤4.1 微生物的培养与对比试验微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称他们是一些个体微小、构造 简单的低等生物，包括属于原核类的细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体；属于真 核类的真菌、原生动物和显微藻类；以及属于非细胞类的病毒与亚病毒。

4】人们大多以为微生物生命力很强，几乎没有不存在它们的“净土”，其实，这是一 种误解事实上，微生物只有在一个比较适宜的环境下才能够生长的旺盛，这样的环境 包括温度、湿度、氧气、酸碱度、营养成分等等我们可以通过在同一条件下培养微生物，然后给出唯一的变量做对比实验其后， 根据所得到的不同的微生物的数量、质量、蛋白质含量等指标来分析这一变量带来的影 响本次实验就是在这一理论基础上进行的4.1.1 实验前的准备4.1.1.1 玻璃仪器的清洗与灭菌将本次实验要用到的三角瓶、试管、移液管、容量瓶、溶剂瓶、培养皿、玻璃棒等清洗干净晾干后，用报纸将移液管、培养皿包扎好，置于高压灭菌锅内灭菌30 分钟 取出，干燥箱内保存4.1.1.2 培养基的选择、配置、分装与灭菌培养微生物的培养基有很多种，最常用的是牛肉膏蛋白胨（MS）培养基，它能够 满足微生物生长的一切需要，若仅仅用来培养微生物，它就足够了；假若你要用来挑选 一些比较特殊品种的话，你就要另作他选了，比如伊红美兰培养基等 【5】本次试验只 是用来培养微生物而已，所以，我选择最常用的MS培养基MS培养基的配方如下：牛肉膏0.3g；蛋白胨lg；氯化钠0.5g；琼脂1.5g；H2O 100ml；pH 7.2-7.4。

配置50ml的固体培养基和200ml的液体培养基；将固体培养基放置于三角瓶中， 用棉塞封好，包扎；液体培养基分装到试管内，每只试管内8ml，用棉塞封好，每十只 一组用报纸包扎好在高压灭菌锅内加入适量的水，将培养基放置于其中，盖好盖子，灭菌 30 分钟， 取出将固体培养基倒于已经灭菌了的培养皿内，静置至其凝固液体培养基静置降温 后，冰箱内-4°C保存4.1.1.3 无菌水的准备在已经清洗干净的三角瓶中加入适量（小于 2/3）的蒸馏水，用棉塞、报纸包扎后 灭菌锅灭菌3 0分钟取出，降温后放置冰箱内保存4.1.1.4 Zn2+母液的配置称取硫酸锌晶体（ZnSO4・7 H2O） 0.2880 g溶解于蒸馏水中，制备成100ml的溶 液，即溶液的浓度为1umol/m l灭菌后冰箱内保存4.1.2 微生物的培养本次实验是以微生物为载体的，所以在对比实验前需要将微生物培养到处于同一阶段，尽量减小因微生物生长状态的不同而产生的误差本次实验考虑到微生物的生存能 力、所需营养物质、结果分析的难易程度等因素，选用了较常见的大肠杆菌图一：显微镜下的大肠杆菌图二：大肠杆菌结构示意图4.1.2.1微生物的复活 久置的微生物活性会降低，因而影响实验结果。

【6】所以，实验前要对其进行复活实验 取冰箱内久置的大肠杆菌，在超净工作台内无菌操作，用划线法将其接种到两个固 体培养基内，恒温培养箱中倒置培养 18~24h4.1.2.2 微生物的液体培养将复活后的菌株接种到液体培养基内，接种5*2支试管，棉塞塞好，做好标记（a、b、c、d、e）后置于大烧杯或广口瓶中，摇床培养18〜24h4.1.3 对比实验 将培养好已经处于同一生长阶段的微生物进行对比实验，在超净工作台内将每支试 管内加入不同浓度的 Zn2+4.1.3.1 Zn2+处理每支试管内具体浓度如下：（单位：umol/ml）表一：Zn2+浓度梯度abcdeZn2+浓度00.0250.0500.1000.200对每支试管内的细菌作如下处理每支试管内加入的物质如下：（单位：ml）表二：大肠杆菌处理实况a b c d eZN2+溶液 0 0.25 0.50 1.00 2.00无菌水 2.00 1.75 1.50 1.00 04.1.3.2摇床培养将已经处理完毕的试管（5支*2）放置于大烧杯内，摇床培养18〜24h4.1.3.3 后继培养 摇床培养后的细菌数量较少，很难得到要得的结果，这就需要后继培养。

将摇床内的试管取出，分别接种于洁净的液体培养基（8ml）内，做好标记（1、2、3、4、5）， 摇床培养18〜24h4.2 蛋白质提取从已经培养到对数期的菌液（各8ml）中提取蛋白质以进入下一步实验：4.2.1 收集菌体用离心法收集菌体：将菌液悬浮于PBS中，加入等体积（8ml）的2倍SDS-PAGE样品缓冲液（还原型），100C 煮沸 3min，然后 104r/min 离心 lmin⑺4.2.2 收集蛋白质溶液离心后的离心管里分成上下两层，取上清液，即为蛋白质溶液4.3 蛋白质含量测定4.3.1紫外分光法测定蛋白质浓度在紫外分光光度计上，将未知蛋白质溶液（2、3、4、5 组）小心的盛于石英比色皿 中，以1组为对照，由于本次实验中的蛋白质样品为混合蛋白质，故用A280nm处的吸 光度来计算 [8]计算公式为： C=0.75*A280nm实验结果如下：表三：蛋白质浓度实验组与对照组280nm处吸光度蛋白质浓度C11.35231.014221.41241.051831.55381.165441.45021.087651.00740.7756在Excel中，蛋白质浓度对Zn2+浓度作图，得到图像如下:0 0.1 0.2 。