叶绿素实验报告.docx

叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定食品092一、实验目的：二、产品验收指标 项目和指标1项目丨指标1pH | 9.0 〜10.71％ |E 405nm 三 |5681cm |消光比值 | 3.2〜4.0总铜(Cu), % |4.0〜6.0游离铜（Cu）, %W | 0.025砷(As), % W |0.0002铅(Pb), % W |0.0005干燥失重，% W| 4.0硫酸灰分，% W| 36.01三、实验原理:四、仪器和试剂（一）、试剂：1、蚕沙（50克） 2、95%乙醇 3、NaOH 溶液 4、稀盐酸 5、丙酮 6、石油醚7、CuS04溶液 8、蒸馏水 9、40%乙醇（纯乙醇与蒸馏水按2:3配）10、5%NaOH-乙醇溶液 11、pH试纸 12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5） 取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21： 4混合（二）、仪器：A、 叶绿素的提取叶绿素铜钠合成1、 温度计 1支 回流冷凝管 1支 500ml 圆底烧瓶 1个恒温槽 1台 滤瓶及漏斗 1个 胶头胶管 1个 玻璃棒 1支 100mL量筒 1个 铁架台 1台电热恒温水浴装置 1套2、 减压蒸馏装置 1台3、 台氏天平 1台4、 PH试纸 若干B、 叶绿素铜钠质量分析1、 751分光光度计 1台2、 台式天平、分析天平 各1台3、 玻棒 1支 胶头滴管 1支10mL、50mL量筒 各一个 100mL、50mL容量瓶 各1个25mL、1mL 吸量管 各一支4 、试纸 若干 吸耳球 一个五、实验步骤（一）叶绿素铜钠的合成1、叶绿素的提取：（1） 在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。

2） 将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60°C（防止叶绿素a和b分解），浸 泡提取2小时，滤出提取液3）按步骤2用乙醇重复2次 4 ）合并3次提取液，在减压、不超过6 0摄氏度下蒸出乙醇趁热倾出瓶中液 体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）2、皂化：将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-CHOH溶液调节使其pH=11，用25水浴加热在60 C下皂化回流1小时3、萃取： 将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分 层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：取上层液少 许置于小烧杯中，加入2—3倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色 则不完全皂化取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚平行萃取 3次4、调酸铜代：将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加 入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60 C 下保温搅拌1小时趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水， 析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、 40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、 ㈡ 及残留的叶黄素和其他有机杂质。

5、成盐：洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH=11， 搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不 显绿色则说明完全成盐），将其在60C下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物， 然后再在60 C下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）流程图:溶 剂 NaOH 溶液 不皂化物 溶剂 酸 CuSO4 溶液 滤渣! ! fill!水 稀酒精 NaOH-离析一沉淀一烘干纯化一成盐一过滤一干燥一成品（二）、纯度分析：1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶 中，加水至刻度，摇匀准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇 匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm 波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照类似地配制0.0005%溶液、0.0015% 溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比 色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标 准曲线。

2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中， 加水至刻度，摇匀准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀， 即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm，吸光比A405nm/A630为 3.2〜4.0用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶 液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线3 、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中， 加水至刻度，摇匀从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸 盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm 用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线六、实验现象试验操作试验现象备注称取蚕沙50g墨绿色加入去离子水浸润和95%乙醇 60°C搅拌回流2h蚕沙部分溶解抽滤，保存滤液得到呈墨绿色的液体剩余蚕沙用95%乙醇再次回流2 次抽滤，混合三份滤液得到呈墨绿色的液体提咼产率水浴，减压蒸馏，把合并滤液放 入旋转烝发仪，并在55 C水浴中 加热蒸馏回收95%乙醇得约50mL左右溶液，溶液 成糊状，蒸发液呈无色防止污染 循环利用在浓缩液中加5% NaOH-乙醇调PH值到11,在温度为60C，皂化时为1h溶液出现小气泡皂化过程皂化后，并洗涤加HCl调，PH = 7 加入 10%CuS0 调 PH = 2- — 3,在4搅拌下温度60°C，保持1 h左右PH试纸变红色此时慢慢出 现胶状墨色悬浮物叶绿素铜酸趁热过滤，滤渣先用水洗去，再 用95%乙醇洗涤3次后抽干。

合 并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏 水，静置过夜后过滤得墨绿色物质 洗涤液呈绿色 固体溶解得绿色液体得墨绿色粉末叶绿素铜钠滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇 及石油醚洗涤3次，放进烘箱中 烘干石油醚层变为浅绿色以除去其中 的H+ Cl及残 留的叶黄素和 其他有机杂质称取0.010g叶绿素铜钠溶于蒸 馏水配成0.1%溶液，再稀释25 倍，测其pH值除去水分得墨绿色结晶物略有胺味 结晶物0.0483g七、实验数据与处理一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线标准曲线的测定方法：取标准样品配制 0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管 分别精确量取 2.5 mL；2.0mL；1.5mL；1.2mL；1.0mL；0.5mL 移至 5 个加入 100mL 的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液，摇匀定容至 刻度，即 0.0025%；0.002%；0.0015%； 0.001%；0.0005%以缓冲液作空白对 照，分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405如表1、图1所示表1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）溶液百分数（％） A4050.00050.1980.0010.3620.00150.5520.0020.7160.00250.924溶液存分禽屋x + 0*0080. 998逼主％1〔L 0015二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线（一）标准样品：取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm的 比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一 次），以缓冲液作空白对照。

测定数据如表 2所示，吸收曲线如图 2 所示表 2 标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长/nm350355360365370375380385390吸光度0.1420.1500.1570.1660.1770.1970.2170.2590.292波长/nm395400405410415420425430435吸光度0.3270.3570.3790.3770.3380.2720.2130.1690.139波长/nm440445450455460465470475480吸光度0.1190.1040.0920.0830.0740.0670.0600.0550.050波长/nm485490495500505510515520525吸光度0.0470.0440.0420.0410.0400.0390.0380.0370.037波长/nm530535540545550555560565570吸光度0.0380.0390.0390.0390.0390.0370.0360.0400.043波长/nm575580585590595600605610615吸光度0.0400.0420.0430.0430.0430.0410.0430.0460.052波长/nm620625630635640645650655660吸光度0.0590.0670.0710.0690.0640.0570.0490.0440.039波长/nm665670675680685690695700吸光度0.0350.0320.0290.0260.0240.0210.0190.017图2标准旧緑素铜钠吸收曲线3 5 2 5 1 * 2 * 1 * O- * O- * O- (V?」=丄品〔）（二）产品： 1 10 190 5 10 590 610 690 710取产品配制0.004%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色 杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次）， 以缓冲液作空白对照。

测定数据如表 3 所示，吸收曲线如图 3 所示数据记录: 1、产品的质量是0. 0483g （借第12组：冯奕淇和雷春雨的实验结果）2、 产品产率:W=0.0483/50*100%=0.0966%3、 吸光比=A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8表 3 产品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长/nm350360。