级分子生物学考试答案, 副本.doc

江西农业大学江西农业大学 20142014 级硕士研究生级硕士研究生 《《高级分子生物学高级分子生物学》》课程考试试卷课程考试试卷姓名：姓名： 专业：专业： 学号：学号： 成绩：成绩： 1、 何谓基因、基因组？各种模式生物体的基因组大小和基因数有何规律？在分子生物学中，基因是一段携带功能产物（多肽、蛋白质、tRNA、rRNA、和某些小分子 RNA）信息的 DNA 片段，是控制某种性状的遗传单位基因一般由结构基因和调控基因序列构成，结构基因编码多肽链或者 RNA 部分，调控序列位于基因 编码区两侧，与转录调控有关基因组是指生物体的一套完整的单倍体遗传信息通常在计算基因组大小的时候以 DNA 含量（全部 DNA 的碱基对总数）来表示从几种模式生物的基因组大小和数据数来看物种基因组大小基因数人30 亿30000实验小鼠26 亿30000拟南芥1 亿25000圆线虫0．97 亿19000果蝇1.37 亿13000酵母0.12 亿6000大肠杆菌460 万3200支原体58 万480乙肝病毒32004其中可以看到基因组大小随着生物的复杂和进化程度越高基因组就越大，几乎成正比例关系，基因数由于生物基因组的结构特征的差异人和实验小鼠的基因组数相差 3 亿但是基因数却几乎相同，因此可以看出生物进化程度与基因大小不完全成比例。

2、什么是致死基因座（Lethal loci）？如何鉴定？生物体的进化程度与致死基因座的变化有何规律？2、 试述核小体的基本组成，核小体任何包装成染色单体？核小体是染色质的重复单元，它由 200 对碱基和组蛋白 H2A、H2B、H3及 H2各两个分子和 H1一个分子所组成每一种组蛋白各3、 比较原核和真核生物 DNA 复制的差异；设计一个实验证明 DNA 的复制是“双向”进行的原核生物每个细胞都只含一个染色体，真核生物每个细胞常含多个染色体在原核和真核生物 DNA 复制中都需要有复制模板、4 种脱氧核苷三磷酸为原料，一段小 RNA 作为引物，ATP、无机离子、各种酶和蛋白因子但是在复制过程中原核生物和真核生物所需的引物、酶和蛋白因子存在一定差异首先他们所需的 DNA 聚合酶种类有差异，原核生物 DNA 聚合酶是由 DNA-pol I，DNA-pol II，DNA-polIII 三种酶组成，其中 polIII 用于新链的延伸真核生物 DNA 聚合酶有 5 种组成，包括 DNA-pol，、、、五种组成，其中用于线粒体 DNA 复制，用于延长新链DNA 的复制起始阶段，原核生物形只有一个复制起点，起始识别点为 DnaA，引物长而多，多为双向复制，形成复制叉。

真核生物有多个复制起点，形成多个复制单位，引物短且少，复制反向多为双向复制复制的终止，原核生物 DNA 为环状，真核生物为线性因此在真核生物中 DNA 的复制和核小体的装配同步进行通过放射自显影的实验可以判断 DNA 的复制是双向进行的，在复制开始时，先用低放射性3H-脱氧胸苷标记大肠杆菌，数分钟后，再转移到含有高放射的3H-脱氧胸苷培养基中继续进行标记，这样，在放射自显影图像上，复制起始区的放射性标记密度会比较低，感光还原的银颗粒密度就较低，继续合成区标记密度较高，银颗粒密度也较高，若是单向复制，银颗粒密度分布就会一端高一端低，若是双向则是中间低，两边高4、 简述动态突变性遗传病的 DNA 动态变化规律由于脱氧三核酸串联重复的拷贝数大大增加所致，这种拷贝数增加的变化会随着世代的传递而不断扩大、扩增，故被认为是一种动态的突变，在人类细胞中，当动态突变发生在转录序列内或者附近时，就有可能对基因转录或其表达产物产生影响，从而表现出疾病症状，他所导致的疾病就被称为动态突变性遗传病动态突变的产生是一个多步骤的过程，包括重复拷贝数或者碱基组成发生低频率的、少量的变化，从而产生相对不稳定数量的完全重复序列。

动态突变的一般规律有：1、突变率与完全重复拷贝数有关 2、等位基因中的完全重复拷贝数的增加是由一些发生频率低的碱基组成变化累积形成，3、在重复拷贝数与发病年龄以及与治病严重程度之间具有相关性由于动态突变具有上述这些特性，所以由动态渡边所致的遗传病，具有驻代增加发病率或治病严重性的特点5、 在研究过程中 发现一个可能的真核转录延伸的负调控因子命名为TFⅡNENG（已拿到其全长 cDNA），设计实验计划研究其功能，并给出可能出现的实验结果在发现的对于可能的负调控基因功能研究中，首先根据其全长 cDNA 的保守序列分析设计引物进行扩增并且克隆进具有真核生物表达系统的宿主菌中，我们选择酵母菌1）最直接的方法就是把你的 cDNA 连接到表达载体中，然后转化酵母中表达，然后检测所表达的蛋白质的功能；根据实验需要选择合适的表达载体选择强启动子,与报告基因组成融合蛋白2.根据表达载体的多克隆位点选择合适的限制性内切酶位点，确保cDNA 序列中没有这些位点3.设计带有这些酶切位点的 PCR 引物，以cDNA 为模板，扩增其编码序列需要绝对注意的问题：如需表达融合蛋白，切记不能让插入片段（报告基因在前）或插入片段以后（报告基因在后）的序列发生移码。

可通过在引物上添加补齐碱基来解决其它需要注意的：引物 5‘端至少加 3 个保护碱基，否则下一步无法进行4.PCR 产物和载体质粒同时用对应限制性内切酶进行切割，回收酶切产物5.插入片段和线性化载体按 3：1 的比例，使用 T4DNA 连接酶进行连接4 度过夜重组 DNA分子导入酵母中，筛选观察酵母生长情况发现含重组 DNA 的酵母生长情况不太好2）通过基因敲除（knockout）的方法来研究基因的功能；敲除掉这个基因后，做一个northern 来分析体系中的 mRNA 的量以小鼠为实验对象，敲除掉这个基因后观察老鼠的生长情况发现相比于没有敲掉的小鼠生长更好3）设计 siRNA,通过 RNA 干扰技术来研究基因的功能同样以小鼠为研究对象，这个基因沉默以后发现生长情况比没有沉默的好7、细菌的半乳糖 operon 在存在 glucose 时仍然可以被诱导，试解释之并说明其对细菌正常生理过程的意义大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括 3 个结构基异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT)，半乳糖激酶(galactose kinase, galk)。

这 3 个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸gal 操纵子的特点：1.它有两个启动子，其 mRNA 可从两个不同的起始点开始转录；② 它有两个 O 区，一个在 P 区上游-67--53，另一个在结构基因 galE 内部因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal 操纵子仍可被诱导分析 gal 操纵子 P-O 区的 DNA 序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅 5bp 的启动子，可以分别起始 mRNA 的合成每个启动子拥有各自的 RNA 聚合酶结合位点 S1 和 S2从 S1 起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA 聚合酶与S1 的结合需要半乳糖、CAP 和较高浓度的 cAMP从 S2 起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的 cAMP-CAP 能抑制由这个启动子起始的转录当有 cAMP-CAP 时，转录从 S1 开始，当无 cAMP-CAP 时，转录从 S2 开始半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal 是通过半乳糖差向异构酶的作用由 UDP-葡萄糖合成的，该酶是 galE基因的产物。

生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶现在设想只有 S1 一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于 cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶假如唯一的启动子是 S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于 cAMP-CAP 的启动子（S1）对高水平合成进行调节8、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样才能阐明该基因的功能？请你根据自己熟悉的某种真核生物提出具体的研究方案在获取到一段未知基因克隆后，首先对未知功能的基因片段进行测序，将得到的测序片段在基因数据库中进行 BLAST 同源对比，根据同源对比结果进行基因功能的预测，并对得到的基因序列进行分析解读，可大致的根据生物信息学的比对和推测进行基因功能的预测和推断在对其未知功能基因的推断之后，需通过基因的表达和表型变化才能具体阐明该基因的功能通过软件分析基因序列片段后，根据其相关的限制性内切酶序列，和酵母表达载体的序列对比，找出合适的限制性内切酶，进行酶切、连接构建重组质粒，并通过转化导入到宿主菌内进行表达如若未知基因内无合适限制性内切酶片段，可根据保守序列分析设计 PCR 引物引入限制性酶切位点，再通过酶的剪切、连接构建重组质粒并转化导入酵母菌宿主内，可根据重组工程菌与原始菌株的表型变化来判断和阐明该基因的功能。