（完整版）质粒DNA生产工艺的研究进展.doc

精品.综述： 质粒DNA生产工艺的讨论进展一、质粒DNA细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的全部质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子[1]，质粒DNA分子可以连续稳固地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2]，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以瘦长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3]；环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子[4]；用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、挑选标记和目的基因和启动子[5]，为了获得高稳固性、高产量的质粒DNA，在构建质粒DNA时，需认真从以下几个方面着手考虑；1. 质粒复制子的挑选Prazeres[6]报道到2021年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450亿美元，质粒DNA的需求不断加大；因此，无论从科学仍是经济角度动身，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的挑选特别关键，目前，绝大多数学者挑选拷贝数高且仅需宿主编码蛋白的ColE1复制子[7]；在携带ColE1复制子的质粒中，RNAII是复制的正向调剂分子，RNAI是复制的负调剂物，另外，由质粒编码的一种Rop/Rom蛋白可提高RNAI与RNAII结合的效率，增强RNAI的负调控作用，因此，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高3至4倍[8]；Yavachev 和 Wang [9-10]讨论报道非荷载的转移RNA的二氢尿嘧啶环、反义环和CCA序列可与RNA I或RNAII的环有高度的同源性，从而会影响到质粒DNA的复制，但是其具体机制仍有待进一步的讨论；据Minton[11]报道，pUC19系列载体同样被缺失了rop基因，但其与其他缺失rop基因的质粒在拷贝数上的表现却不尽相同，这是由于pUC质粒在RNAII序列上带有一个G到A的点突变，可依温度的不同而转变正向调剂分子RNAII的二级结构，Chambers S &Yanisch-Perron C等讨论说明在42℃或者45℃下，RNAII好像折叠成抗RNAI抑制的构型，于是DNA合成的起始加强，结果拷贝数特殊高[12-14]；尽管构建DNA疫苗时普遍使用ColE1类型复制子，但Uhlin B & Remaut E报道的一种由低拷贝进展而来的由温度掌握的“失控型”复制子同样具有庞大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达1000[15-16]，Ansorge M和Chao Y证明这种拷贝数已胜利地应用来表达大量的重组蛋白[17-18]，尽管“失控型”复制子的优势特别明显，但仍没有使用这个类型复制子来构建DNA疫苗的胜利例子，至今不清晰什么是导致此种复制子未得到开发的具体缘由[19]；2. 抗性基因的挑选在挑选抗生素抗性基因时，由于极少量即可引起部分人群剧烈的过敏反应，第一应防止β-内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素[20]，由于这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适[19]；3. 其他元件的考虑设计、构建DNA疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经特别明显，它除了必需包括一个能使质粒在大肠杆菌中维护、分裂的元件；一个能促使目的基因在机体内表达的元件和挑选标记外，仍包括其他一些调控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳固[21]，这些元件包括真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1α及UbC和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更为有效，其中内含子A更能提高CMVI/E的表达水平[22]，CMV现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA疫苗来说是特别有帮忙的；另外，一些抗原基因本身来源的启动子也可用来构建DNA疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的成效不明显；常用的转录终止子及终止信号包括牛生长激素（BGH）、SV40及人β-珠蛋白；此外，在构建DNA疫苗时，可利用非甲基化的细菌DNA-CpG寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA疫苗的免疫原性，这是由于真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右[24]，这种频率上的差异使得其与模式识别受体TLR-9的相互作用，提高了免疫应答水平[25]；4. 目的基因在挑选和构建质粒DNA时，第一应考虑的是质粒DNA可否整合入宿主基因组，因此，在挑选目的基因时，须严格防止目的基因同人类基因组之间具有长片断的同源序列；启动子和终止子同样须认真挑选以严格掌握其生物学活性；此外全部构建质粒DNA的过程需要有具体的记录，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鉴定[26-32]；5. 质粒的稳固性质粒DNA导入宿主细胞后，必将引起宿主菌生理发生转变[33]，质粒的复制增加了宿主菌的负担，引起宿主菌生长速率下降，使得重组工程菌的发酵过程比非重组菌的发酵过程复杂化，进而有可能降低质粒DNA的稳固性；同时，外源基因的插入也会干扰到质粒本身的稳固性，在以大肠杆菌为宿主的发酵过程，仍必需考虑到宿主菌的遗传特性[34-36]，判定其是否存在可以降解重组DNA，或者产生引起重组DNA的不稳固性的蛋白酶或其他一些蛋白分子；5.1 质粒不稳固性的概念质粒不稳固性，是指工程菌在生长过程中重组质粒发生变化，结果不出现原有的表型特点；质粒不稳固可分为两类：分别不稳固性和结构不稳固性[37]；分别不稳固是指在细胞分裂中由于缺陷安排引起部分或全部质粒的丢失；结构不稳固就是由于重组质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒的安排不稳固性和结构不稳固性的结果都将使我们得不到预期的质粒产量和质量；假如发生质粒分别不稳固，由于部分重组质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒的宿主菌的混合培育，Imanaka[38]证明在非挑选性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于宿主细胞的比生长速率〔μ-〕，经过25代后，培育液中几乎都是无质粒的细胞；5.2 质粒拷贝数质粒拷贝数是表达质粒稳固性的一个重要特点，拷贝数第一打算于自身的遗传特性，同时也受到宿主菌生理状况及生长环境的影响，Enberg & Nordstorm[39]讨论认为宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降，这可能是高比生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降；此外，Koizumi[40]的讨论同样证明白养分物质的限制或缺乏也会导致质粒拷贝数的下降；一般来讲，质粒拷贝数对质粒稳固性的影响因质粒的不同而不同，Futcher & Cox[41]对几种质粒的稳固性进行了讨论，发觉质粒稳固性随着拷贝数的增大而增加，但当质粒拷贝数太高时，质粒也往往不稳固，因多次复制，增加了出差错的机会；5.3 培育方式对质粒稳固性的影响培育基对质粒的稳固性也起着特别重要的作用，Caulcott [42]讨论说明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培育基；低温往往有利于重组质粒稳固地遗传，而当温度高于50℃时，重组质粒在分批培育的对数后期和连续培育时均出现遗传不稳固状态[43]；5.4 解决方法在重组基因工程菌发酵过程中，克服质粒丢失的最广泛使用也是最有效的方法就是添加针对抗性基因的抗生素；FDA规定不管在生产仍是治理上都应用卡那霉素代替氨苄青霉素，其缘由是考虑到β内酰胺类抗生素是一种剧烈的过敏原；另外，用抗生素添加法来排除质粒脱落性的不稳固性在大规模生产时并不行取，由于这种挑选压力只能维护一段时间，要从根本上解决这个问题，需要讨论影响质粒稳固性的各个过程（质粒的复制、质粒的转移及质粒在子代细胞中的安排等）[44]；此外，质粒的平稳致死系统有可能为完全摒弃抗生素的使用奠定基础[45]；二、菌种库的建立对转化大肠杆菌的条件进行优化；建立原始种子库；分析种子库的遗传稳固性，要明确该种子库可以传代的次数；在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库没有噬菌体和其它外源因子的污染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括基因型、表型未发生转变；应检测细菌的外形学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态；并对工作细胞库的规模、储存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳固性（拷贝数及表达量）、答应的传代次数等进行讨论；三、含重组质粒基因工程菌的发酵影响质粒 DNA 产量的因素最重要的是宿主菌株的遗传背景和质粒分子本身的拷贝数，除此之外，在工业发酵中宿主菌株的生长条件和培育基类型也是不行忽视的条件；一般建议使用 endA 基因发生突变的（endA1）大肠杆菌宿主菌株，例如 DH5α，JM109，以及 XL1-Blue 等，由于 endA 基因突变的结果，使得大肠杆菌宿主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶Ⅰ的才能，从而增进了所含质粒 DNA 分子的稳固性[46]；在典型的分子生物学试验中，质粒是由大肠杆菌在摇瓶中发酵生产的，温度、转速和培育基是唯独可掌握的因素[47]；一般培育物的质粒产量在 1-10mg 之间；在高密度培育的发酵罐中，诸如培育基组成、温度、pH 值、溶解氧、积存的代谢产物，搅拌速度等影响细菌及质粒产量的因素都能得到监测和掌握，质粒产量可达摇瓶的10到50倍[48]，Lahijani R[49]的讨论数据显示每升培育基可以产出220mg质粒DNA，Schmidt T[50]也说明质粒产量可达225mg/L；高密度培育技术的显现，不仅能增加产率，而且也为削减发酵罐容积、减轻分别纯化、削减污水、降低能耗和成本带来好处；3.1 培育基的组成大肠杆菌可以在养分丰富或贫乏的培育基中生长，但是养分物的种类及来源对质粒DNA的质量和数量都产生重大影响[51]；由于可生产高的细胞密度，丰富的、复合培育物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受欢迎，肉膏由于可能含有疯牛病等动物病毒而成为潜在的污染源被排除在外；除了丰富养分物，仍需加入葡萄糖或甘油等碳源物质，Korz[52]讨论说明，以甘油为基础的碳源培育基的生长速度较慢，几乎不产生乙酸，终产物也比以葡萄糖为碳源的培育基多，但当它们超过肯定的范畴时都会阻挡细胞的生长，这就说明白为什么在间歇发酵中增加养分物的浓度并不能得到高细胞密度的缘由；目前，常用的有三种形式的培育基：限制性培育基、半限制性培育基和复合培育基，其可重复性依次降低；O’Kennedy[53]的讨论结果说明，半限制性培育基生产质粒pSV的产量为9.12μg/mg干菌，比复合培育基的4-6μg/mg干菌高一些；同时， O’Kennedy[54]仍证明白用于质粒生产培育基正确的C︰N为2.78︰1，最大比例不要超过12︰1，由于在此范畴内，细菌膜上的肽聚糖的成分没有发生转变，不会影响到化学裂解的特性，在试验过程中，O’Kennedy仍发觉添加氨基酸后的限制性培育基SDCAS，无论在提高质粒超螺旋的比例上仍是在削减质粒的丢失率上都比LB培育基的成效好，且SDCAS经碱裂解后产生的宿主基因组DNA也明显削减；3.2 发酵方式的挑选发酵一般以分批或者流加的方式进行[55]；在这两种方式中，流加发酵可以提高细胞密度，并因此可能转变质粒的质量，Matsui[56]报道在发酵过程中添加固体葡萄糖，可以使DCW〔dry cell weight〕达到134g/L，质粒在细胞中一般出现负超螺旋结构，但据明白，宿主菌的生长条件，溶解氧及温度等的转变都可以转变超螺旋质粒的密度[57]；D.J.Korz[58]讨论证明，溶氧不足或CO2过剩都会促进乙酸形成，促使细胞衰老和死亡，降低质粒DNA的产。