四环素碱性降解产物作为荧光标记物的制备及性能评价.docx

环素碱性降解产物作为荧光标记物的制备及性能评价摘 要： 以四环素为原料，在碱性条件下降解产物作为荧光标记物（ Flu-TC），对荧光标记物的制备条件进行优化，并用自制的磁性四环素分子印迹聚合 物（TC@FeO@SiO@MIP）评价其吸附性能结果显示，四环素碱性降解产物具有3 4 2荧光特性，且 TC@Fe O @SiO @MIP 对 Flu-TC 具有一定的选择性识别性能，可以作3 4 2为荧光标记物为下一步建立磁性分子印迹荧光免疫竞争吸附方法奠定基础关键词：四环素；碱性降解；荧光标记物；制备；性能评价分子印迹荧光免疫分析法是分子印迹免疫法和荧光标记物相结合的分析方法 既有分子印迹聚合物特异性高、检测迅速、分析成本低等优点，又有荧光标记技 术灵敏度高、检测限低、重复性好、无放射性、健康环保等优点［1］作为免疫分 析法的一种，分子印迹荧光免疫分析法同样存在两种模式，即分子印迹荧光免疫 竞争分析法和分子印迹荧光免疫替代分析法在该方法中，荧光标记物的选择非 常关键，分子印迹聚合物不仅对目标分析物有特异性吸附，而且对荧光标记物也 要有一定程度的选择性吸附，这就要求荧光标记物的结构与目标分析物的结构相 类似。

四环素类抗生素分子内含有共轭双键系统，在紫外光照射下会产生一定强度 的荧光，四环素本身荧光信号较弱，不能用于分析碱性条件下，四环素降解产 物有很强的荧光特性［2］（反应路线见图 1），根据这一特性制备四环素碱性降解 产物，将该产物作为荧光标记物Flu-TC3由于目标分析物四环素和Flu-TC结 构相似，满足荧光探针要求本文以四环素为原料，碱性条件下降解制备得到Flu-TC，以自制得到的 TC@Fe O@SiO @MIP 对其吸附性能进行评价，并对其进行吸附动力学实验、吸附等3 4 2温线实验，为下一步建立分子印迹荧光免疫法测定牛奶等复杂基质中四环素类抗 生素残留方法建立打下基础为了简化表述，以MIP代替TC@FeO@SiO@MIP，以3 4 2NIP代替Fe O @SiO @NIP，四环素碱性降解产物荧光标记物用Flu-TC代替3 4 21 实验材料1.1实验仪器荧光分光光度计F95S （上海棱光技术有限公司）；超声波清洗机SK3200H（上海科导超声仪器有限公司）；Sartorius电子分析天平（BSA124S,北 京赛多利斯科学仪器有限公司）；台式摇床（QB-228,海门市其林贝尔仪器制造 有限公司）；封闭式调温加热器（MB-1-1,北京科伟永兴仪器有限公司）；雷磁 pH计（PHS-3C,上海仪电科学仪器股份有限公司）1.2实验试剂四环素（纯度±98%,上海晶纯生化科技股份有限公司）；氢氧化钠（分析 纯，上海展云化工有限公司）；盐酸（分析纯，上海展云化工有限公司）；乙腈（分析纯,天津医药化学有限公司）；甲醇（分析纯,天津市风船化学试剂科技 有限公司）；自制MIP和NIP、三蒸水；2 实验方法2.1荧光标记物（Flu-TC）的制备取0.50mg/mL四环素甲醇溶液1mL，置于15mL具塞试管中，加入0.5mL0.3mol/L的NaOH，加水稀释到5mL，相同条件下配置空白液，均避光，放入沸水 中加热4h降解，取出冷却后待测液与空白液均加稀盐酸（0.01mol/L）中和至 pH=7。

2.1.1 反应体系溶剂的优化取25mg四环素分别用甲醇、0.010mol/L盐酸为溶剂配置浓度为0.50mg/mL 的四环素甲醇溶液、四环素盐酸溶液1） 取0.50mg/mL四环素甲醇溶液1 mL，0.30mol/LNa0H溶液0.5mL加水稀 释到5mL；相同条件下以不加TC的溶液为空白，避光放入沸水中加热，反应平衡 时取出，冷却至室温后，在荧光分光光度计上于激发波长365nm和发射波长 412nm测定荧光值强度F2） 取0.50mg/mL四环素盐酸溶液1 mL，0.30mol/LNa0H溶液0.5mL加水稀 释到5mL；相同条件下以不加TC的溶液为空白，避光放入沸水中加热，反应平衡 时取出，冷却至室温后，在荧光分光光度计上于激发波长365nm和发射波长 412nm测定荧光值强度F2.1.2 四环素碱性降解反应时间的选择取配制好的0.30mol/LNa0H溶液0.5mL，加入1mL0.50mg/mL的TC甲醇溶液, 加水稀释到5mL；相同条件下以不加TC的甲醇溶液为空白，均避光，放入沸水中 力口热，于 40min、80min、120min、160min、180min、200min、220min、240min 时分别取出，冷却后测定出荧光值。

2.1.3 碱浓度的选择取配制好的 0.10mol/L、0.30mol/L、0.50mol/L 的 NaOH 溶液 0.5mL 于三只 15mL的具塞试管中，分别加入1mL 0.50mg/mL的TC溶液，加水稀释到5mL，相 同条件下以不加TC溶液配制成空白样品，均避光放入沸水中加热，40min、 80min、120min、160min、180min、200min、220min、240min 时分别取出，冷却 后测定出荧光值2.1.4 碱性溶液体积的选择分别取配制好的 0.30mol/LNaOH 溶液 0.5mL、1 mL、2 mL、4 mL、5mL,加入 1mL的0.50mg/mLTC甲醇溶液，加水稀释到5mL；相同条件下以不加TC的甲醇溶 液为空白，均避光，放入沸水中加热4h，取出冷却后测定出荧光值2.1.5 四环素浓度的选择取配制好的 O.3Omol/LNaOH 溶液 0.5mL，分别加入 ImLO.lmg/mL、0.2mg/mL、 0.50mg/mL、lmg/mL、2 mg/mL的TC甲醇溶液，加水稀释到5mL；相同条件下以 不加TC的甲醇溶液为空白，均避光，放入沸水中加热4h取出，冷却后测定出荧 光值。

2.1.6 四环素体积的选择取配制好的 0.3Omol/LNaOH 溶液 0.5mL，分别加入 0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、5mL的0.50mg/mL TC甲醇溶液，加水稀释到5mL；相同条件下以不加TC的 甲醇溶液为空白，均避光，放入沸水中加热，4h取出，冷却后测定出荧光值2.2 MIP对Flu-TC的吸附性能评价2.2.1 Flu-TC稀释溶剂选择取11支15mL干燥洁净的具塞试管，平均分为A、B两组，A中加入Flu-TC 溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL，A组加水稀释到10mL （浓度分别为 0.21mg/L、0.42mg/L、0.84mg/L、1.68mg/L、3.36mg/L），向 B 中加入 Flu-TC 溶液 0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL、3.2mL，B 组加甲醇稀释到 10mL 浓 度分别为 0.21mg/L、0.42mg/L、0.84mg/L、1.68mg/L、3.36mg/L、6.72 mg/L； 以中和后的无Flu-TC的溶液为空白对照，均避光，于激发波长365nm和发射波 长412nm下，测定出荧光值。

以荧光值F为纵坐标，Flu-TC溶液的浓度为横坐标, 绘制曲线图，选择合适的稀释溶剂2.2.2 标准曲线的绘制取6支15mL干燥洁净的具塞试管，分别向其中加入Flu-TC溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL、3.2mL，加甲醇稀释到 10mL （稀释倍数为 100 倍、 50 倍、25 倍、12.5 倍、6.25 倍、3 倍，浓度分别为 0.21mg/L、0.42mg/L、0.84mg/L、1.68mg/L、3.36mg/L、6.72mg/L,避光，于激发波长 365nm 和发射波 长412nm下，以中和后的无Flu-TC的溶液为空白对照，测定荧光值以荧光值F 为纵坐标，Flu-TC溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线2.2.3 MIP对Flu-TC的吸附动力学实验分别称取MIP和NIP各4 mg，置于15 mL离心管中，取浓度为1.68mg/LFlu-TC溶液12mL，以相同条件下得到的不含Flu-TC溶液的甲醇溶液为空白对照 室温下避光振荡，于 2、4、6 、8、10、12、14、16h 取出混合液，用磁铁分离， 取上清液用荧光分光光度计于激发波长365nm和发射波长412nm下测定其荧光值, 根据标准曲线计算不同吸附时间Flu-TC的浓度。

计算聚合物对Flu-TC的吸附量 Q(mg/g)Q=(C -C )・V/mo1其中C、C分别表示吸附前后溶液中模板分子的浓度(mg/L) ； V表示溶液的01体积(mL)； m表示加入的分子印迹聚合物的质量(mg)绘制吸附量与时间关系的 动力学曲线2.2.4 等温吸附曲线的绘制分别称取6份MIP和NIP各4mg，置于15mL的离心管中，分别加入 12mL0.21mg/L、0.42mg/L、0.84mg/L、1.68mg/L、3.36mg/L、6.72mg/L 的 Flu- TC溶液，室温下振荡16 h达到吸附平衡后，将各混合液用磁铁分离，取上清液 于激发波长365nm和发射波长412nm测定荧光值，计算分子印迹聚合物饱和吸附 量Q，绘制吸附等温线3 结果与讨论3.1荧光标记物(Flu-TC)的制备条件优化3.1.1 反应体系溶剂的优化若四环素直接用碱溶解进行水解，碱会破坏其结构，难以得到Flu-TC四环 素虽然溶于水，但在水中分散性较差，从大多文献了解到，一般制备Flu-TC是 直接用盐酸四环素[4-6] ，而甲醇对四环素的溶解性也较好，所以这里的反应溶 剂选用了盐酸与甲醇溶解进行比较。

分别以甲醇、盐酸为溶剂，碱性条件下反应 4h 体系的荧光变化见下图 2 和表 1从图 2、表 1 可看出，相同条件下，用甲醇作为体系溶剂溶解四环素的反应 平衡得到的荧光值大于盐酸作为溶剂时的荧光值，甲醇作为体系溶剂的荧光检测 效果较盐酸好，故选用甲醇作为反应体系溶剂图2甲醇、O.Olmol/L盐酸为溶剂的荧光曲线表1 甲醇、盐酸为体系溶剂荧光强度对比碱性浓度 反应时间 平衡时荧光甲醇 0.30mol/L4h130.378盐酸0.01mol/L)3.1.2 四环素碱性降解反应时间的选择四环素在碱性(0.3mol/LNaOH)加热条件下生成Flu-TC，产物的荧光值随时 间变化图见图3从图中可看出，当反应时间为220min时荧光值开始趋于平衡， 到240min时荧光值无明显变化，确定Flu-TC的反应时间为240min即4h3.1.3 反应体系碱性浓度的条件优化从图4所示氢氧化钠浓度为0.5mol/L时，荧光值上升趋势较缓，整体荧光 值偏低浓度为O.lmol/L时，荧光值上升趋势较急，难以控制时间，反应时间 较长浓度为 0.3mol/L 的荧光值上升趋势、反应平衡时间、整体荧光值等适中 荧光检测条件优于其他两个浓度，于是选择0.3mol/L作为碱性降解浓度。

0 50 100 I5D 2M 250 3IDU■ iirSmnl'L NflrOH图4 NaOH浓度对体系荧光值的影响3.1.4 碱性溶液体积的选择由图5可知，当碱的体积为1 mL时，荧光值稳定不变基本稳定在实验过程 中，随着碱的体积增加，体系荧光值先增大后保持基本不变，但发现碱的体积从 1mL开始就出现大量白色絮状物，溶液浑浊，荧光值测定结果可能受絮状物的影 响，存在误差；另外，絮状物也会干扰后期样品测定白色絮状物的出现可能是由于碱量比较多时，会破坏四环素的结构产生大量副产物；综合考虑，则选择0.30mol/LNa0H的体积为0.5mL为。