实验3PEG介导的动物细胞融合技术.doc

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名：常天易 系年级：海洋生命学院2012级 专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验 学号：12050011006PEG 介导的动物细胞融合技术一、实验目的　　（１）、通过实验，对体细胞融合有一个清醒的认识　　（２）、通过ＰＥＧ介导鸡血细胞融合，初步掌握利用ＰＥＧ介导动物细胞融合的实验技术二、实验原理真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核的细胞的过程称为细胞融合，通过此技术可以实现不同种类的细胞的融合基因型相同的细胞融合称为同核体（ｈｏｍｏｋａｒｙｏｎ），基因型不同的细胞融合称为异核体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ）目前，诱导细胞融合的技术主要有三种：病毒，聚乙二醇（ＰＥＧ），电激第一种方法是通过生物病毒的方式，诱导细胞与细胞之间的融合后两种方法通过化学物理的手段使得细胞膜的膜脂类分子的排列发生变化，去掉作用因素后，质膜分子的排列恢复原有的形态，在恢复的过程中，可以诱导相接触的细胞发生融合ＰＥＧ介导的细胞融合，其融合效果受到以下几个因素的影响①、ＰＥＧ的分子量与浓度ＰＥＧ的分子量及其浓度越大，细胞融合效果越明显，但对细胞的毒性也越大。

本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ，浓度为５０％②、ＰＥＧ的ｐｈ值经验证，ＰＥＧ的浓度在８.０～８.２时，融合效果最好③、ＰＥＧ处理时间处理实验越长，融合效果越好，但对细胞的毒性也越大故一般将处理时间限制在１分钟以内本实验不涉及后续的细胞培养，所以处理时间可适当放宽至数分钟④、融合时的温度温度越高，细胞膜脂质的流动性越好，故在细胞可以承受的范围内，适当的提高温度有利于细胞的融合三、实验材料新鲜鸡血０. ８５％生理盐水ＧＫＮ液５０％ＰＥＧ液四、实验步骤取出鸡血悬液1ml，加入0.85%生理盐水，4ml，混匀1200r/min离心5分钟，移除上清液加入4ml 0.85%生理盐水，重悬细胞，1200r/min，离心5min，移除上清加入4ml 0.85%生理盐水，重悬细胞，1200r/min，离心10min，移除上清向离心沉淀中加入2mlGKN，使之成为10%的细胞悬液取血球悬液1ml，加入0.5ml 50%的PEG液，混匀，开始计时　　从计时开始，到盖上盖玻片在显微镜下观察为止将处理1、2、3、4分钟的细胞样品，显微镜下观察计数视野内融合细胞的核数和视野内细胞的总核数，从而计算融合率计数视野内融合细胞的核数和视野内细胞的总核数，从而计算融合率五、实验结果　　本实验分为四个实验组，经PEG处理的时间分别为：1,2,3,4分钟，各个实验组中视野内融合的细胞的核数，视野内细胞核的总数，融合率如下：处理时间 项目视野内融合的细胞的核数视野内细胞核的总数融合率（%）1min9313767.92min13418672.03min19825677.34min25832080.6处理2min效果六、思考题：１、细胞融合方法主要有哪几种，各有何优缺点？答：目前主要由三种方法，ＰＥＧ、病毒法、电激法。

①、ＰＥＧ介导的细胞融合　　优点：细胞融合率较高，廉价，操作简便　　缺点：ＰＥＧ对细胞有一定的毒性，不适用于对卵细胞的细胞融合，可重复性差②、病毒法,使用副念病毒科的病毒诱导细胞融合　　优点：病毒体外易于培养　　缺点：使用病毒诱导的细胞融合效果不稳定③、电激法： 优点：可重复性强，对细胞无毒害 缺点：成本高２、ＰＥＧ法诱导细胞融合的因素有哪些？答：①、ＰＥＧ的分子量与浓度ＰＥＧ的分子量及其浓度越大，细胞融合效果越明显，但对细胞的毒性也越大本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ，浓度为５０％②、ＰＥＧ处理时间处理实验越长，融合效果越好，但对细胞的毒性也越大故一般将处理时间限制在１分钟以内本实验不涉及后续的细胞培养，所以处理时间可适当放宽至数分钟③、ＰＥＧ的ｐｈ值经验证，ＰＥＧ的浓度在８.０～８.２时，融合效果最好④、融合时的温度温度越高，细胞膜脂质的流动性越好，故在细胞可以承受的范围内，适当的提高温度有利于细胞的融合3、 本实验中所用的PEG融合方法是否适用于植物细胞，为什么？答：不适用因为植物细胞存在细胞壁，使用ＰＥＧ融合方法使得细胞的细胞膜的脂类分子层结构发生暂时的改变，从而介导细胞的融合。

由于细胞壁的存在，组织了植物细胞的融合，ＰＥＧ融合方法所以不适用于植物细胞的融合４、 本实验的本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？如果因实验需要必须选用小鼠血细胞作为实验材料，应如何对融合细胞进行鉴别？答：因为兔子或小鼠等哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，在普通光学显微镜下，不利于计数，所以不适用它们的血细胞进行细胞融合的实验①、可以对细胞表面保守的蛋白进行ＥＬＩＳＡ或免疫荧光染色等处理，分析信号的强度，进行分析②、可以通过化学基团标记细胞，进行分析③、可以测定细胞的呼吸强度等生理特性，代谢强的，为融合的细胞④、融合实验前对细胞进行荧光标记，后可以通过流式细胞术将融合程度不同的细胞分离开来 七、总结与讨论　　1、PEG液要现配现用，因为对人体有害，所以在配置和使用时应当特别注意　　2、实验中所用的Ａｌｓｅｖｅｒ液的作用是①、为细胞提供营养②、防止血液的凝固3、实验所用的ＧＫＮ溶液是一种缓冲液而且也可以为细胞提供营养4、因为在ＰＥＧ的存在下就可以使细胞膜的结构发生变化，PEG处理的时间应该掌握到盖上盖玻片在显微镜下观察为止因为加上盖玻片可以相对限制细胞相对位置，使得细胞融合速度减慢但是不能保证细胞绝对不融合，所以观察到的样品经ＰＥＧ处理的时间一般都比预计的时间长。

5、本实验开始计数时，计数规则出错，计算融合率应用视野内融合细胞的核数÷视野内细胞的总核数；而不是视野内融合的细胞数÷视野内的细胞总数，原因是：　　　　a、前一种方法被除数是融合的细胞的核数可以代表融合的细胞的个数，后一种方法被除数是视野内融合的细胞数不能代表融合的细胞的个数　　　　b、前一种方法除数是视野内细胞的总核数可以代表实验中所有的细胞，后一种方法除数是视野内细胞的总数包括融合的细胞数和未融合的细胞数，不能代表实验中所有的细胞数　　　　c、前一种方法计数时数细胞核目标较为明显，后一种方法计数细胞不易综上，，可以较快，较准地反映出实验组中所有细胞在ＰＥＧ条件下，融合的情况。