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湖南大学 硕士学位论文 拟南芥AKIN11基因的克隆、定位及功能分析 姓名：马毅 申请学位级别：硕士 专业：@ 指导教师：@ 20070430 1 第1章 绪 论 1.1 拟南芥研究进展 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana) 是 十 字 花 科 (Brassicaceae) 拟 南 芥 属 (Arabidopsis) 一年生草本被子植物在自然界中，拟南芥广泛分布于温带的西亚， 中亚、欧洲以及地中海地区；同时在东非、东亚、日本、美洲也都有分布在我 国主要分布在东北、西北以及西南丘陵地带 1842 年，德国植物分类学家 G. Heynhhold 把南芥属和大蒜芥属的一些种类分 离出来，另建立了新属拟南芥,学名为 Arabidopsis，它是由 Arabi（南芥）＋opsis （希腊语“类似” ）组成，意思是南芥属相似[1]在 20 世纪初，植物学家 Laibach 首次提出拟南芥作为一种模式生物的观点 1996 年，来自欧洲、日本、美国的科学家们提出了拟南芥基因组计划，促 进了拟南芥的基因组测序工作迅速地发展 他们将庞大的科研工作分配到上百个 研究小组，每一小组都承担了染色体上某一区域的测序工作。

至 2000 年底，拟 南芥全基因组序列测定完成，结果显示：拟南芥全基因组 125Mb 共含有 25498 个基因，其编码的蛋白质来自 11000 个家族与线虫及果蝇相比，拟南芥基因组 编码的 11000 个蛋白质家族中除了有许多相同或者类似的家族， 还包含了许多新 的蛋白质家族，同时缺少了几种常见的蛋白质家族这一结果表明在这 3 种高等 模式真核生物中，常见的蛋白经历了不同的进化过程例如，拟南芥中只 10 %-20 % 的蛋白质可在其它真核生物基因组中找到相关基因 最新的拟南芥基因组研究进展 可从表 1.1 列出的网址上得到拟南芥基因组核苷酸序列全部公布在互联网，成为 植物界第一个被完整测序的物种，这是生命科学研究发展的一个里程碑我们可 以预计拟南芥序列测定的完成将对植物功能基因组学研究以及科研技术的发展 起到巨大的推动作用 随着对拟南芥研究的深入，人们发现拟南芥作为显花植物遗传学、植物基因 组学和植物蛋白组学研究的经典材料有许多优点: 1.第一个完成测序的高等植物， 并且描绘出由 5 条染色体约 1.15 亿个碱基对组成的有较为精细的遗传学和物理学 图谱; 2. 高等植物中最小的基因组且有很少的重复序列，拟南芥的 2.5 万多基因 在功能类别上却和其他开花植物大致相似；3. 生命周期短(从萌发到种子成熟约 6～8 周)，每年最少可以繁殖 5～6 代；4. 种子体积小且数量多（每株能产生超过 20000 粒种子） ；5. 植株矮小（株高一般为 15～30cm） ，占地少，易于在室内有限 空间培养以及开展实验; 6. 很容易通过物理诱变，化学诱变，以及进行农杆菌介 拟南芥 AKIN11 基因的克隆、定位以及功能分析 2 导的生物转化等人工诱变，获得大量的突变体株系来建立突变体库; 7. 30 多个国 家的政府，大学以及企业实验室等机构成立的几千个强大的研究团体，拥有巨大 的共享资源。

所有这些都使得拟南芥成为一种特别理想的遗传学和分子生物学研 究材料，被广泛用于植物生命奥秘的研究探索 表 1.1 拟南芥信息资源 Table1.1 Research resource of Arabidopsis TAIR http://arabidopsis.org 拟南芥基因组数据库 TIGR http://www.tigr.org/tdb/at.html 基于 EST 的拟南芥非冗余 基因组数据库 NASC http://nasc.nott.ac.uk 诺丁汉拟南芥储藏中心 Lehle Seeds 拟南芥储藏中心 Data http://luggagefast.stanford.EDu/ grop/arabprotein 拟南芥编码序列 PPMdb http://sphinx.rug.ac.be 拟南芥质膜蛋白序列和表 达数据库 MATDB http://mips.gsf.de/proj/thal/db/ 慕尼黑代百序列信息中心 拟南芥基因组数据库 FLAGdb/FST http://genoplante-info.infobiogen.fr 拟南芥 T-DNA 转化数据库 AraClean http://www.cbs.dtu.dk/databases GenBank 中拟南芥序列的修正和冗 余还原数据库 U.Minn http://www.cbc.umn.edu/Research-Projects /Arabidopsis/index.html 拟南芥 cDNA 序列分析 PAT http://arabidopsis.sdsc.edu 拟南芥蛋白数据库 CSH http://genetrap.cshl.org 冷泉港拟南芥生物信息中心 ABRC http://www.biosci.ohio-state. edu/plantbio/ Facilities/abrc/abrchome.htm 拟南芥生物信息中心 AGR 拟南芥基因组资源网 Arabinet http://weeds.mgh.harvard.edu/atlinks.html 拟南芥资源信息网 GARNet http://wwwl.york.acuk/res/garnet/garnet.htm 拟南芥基因组资源中心 被科研人员当做“宠儿”的拟南芥不仅可以作为重要的模式生物来研究植物 生物学，而且有助于人们了解所有高等真核生物的结构和功能方面的基本问题。

开展对拟南芥的遗传学研究尤其是分子遗传学研究， 不仅在理论上有助于揭示物 种的进化、植物的发育、基因的表达和调控等规律，在实践上我们还可以将拟南 芥基因组中与光合作用、能量物质合成积累、器官形态建成、组织发育、抗病抗 3 逆以及控制次生代谢产物合成等有关的基因逐一分离鉴定出来 通过对比分析拟 南芥基因与其它植物 DNA 序列的同源性， 从而将有关序列标记在这些植物的遗传 连锁图上，利用转基因技术转入到重要的农作物及经济作物中，推动植物的遗传 改良工作以获取巨大的经济效益这一工作己在水稻，马铃薯等农作物中得以迅 速开展 1.2 植物酪氨酸蛋白激酶以及 SnRK1 基因家族研究进展 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生物体内能量代谢和信号传递中的重要生化反 应，其中蛋白质的磷酸化是通过蛋白激酶催化完成的蛋白激酶在细胞信号通道 中起化学修饰作用，它通过催化蛋白质磷酸化从而改变其活性，这一类酶用ATP 或GTP作为磷酸基团的供体, 而蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸作为磷酸基 团的受体根据催化底物的特异性，所有已鉴定的蛋白激酶均可划分为两大类别： 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶尽管两类蛋白激酶具有极其相似的催 化功能域一级结构， 但某一段特异性氨基酸序列却能将这两类蛋白激酶区分开来， 从而我们可以准确地预测特定的蛋白激酶将磷酸化哪种氨基酸[2]。

酪氨酸激酶在 一系列细胞活动(例如细胞生长、分裂、分化、死亡、细胞间相互作用、细胞与 细胞外基质相互作用等) 的信号转导途径中起着重要的调控作用， 广泛地参与了 植物对干旱、盐胁迫、ABA诱导、光诱导等的生理反应 蔗糖非酵解相关激酶基因（SNF1）首先在酵母中被发现 [3]，源于其突变体 snf-1 不能够利用培养基中的蔗糖作为唯一碳源而被分离出来SNF1 不仅有调节 编码碳水化合物代谢酶基因表达的功能,还能调节大量代谢酶的活性在植物中已 鉴定出与 SNF1 相似的蛋白激酶,称为 SnRKs(SNF1 相关激酶) 根据氨基酸序列相 似性,植物蛋白激酶可分为五大类, 每一类又被进一步分为不同的组和属，SnRKs 蛋白激酶属于第四类中第二组的第四属[4]植物中 SnRKs 是一个特殊蛋白激酶 家族，Hanks 和 Hunter 将它们归于钙调素蛋白激酶家族（CDPKs）[5]硝酸盐 还原酶在菠菜中被钙依赖的 CDPK 和一个 SnRK 基因磷酸化[6]SnRKs 分为 3 个 亚族(SnRK1、 SnRK2、 SnRK3), 其中 SnRK1 亚族与酵母的 SNF1 和哺乳动物的 AMP 依赖蛋白激酶有 48％的氨基酸同源性，其中以上三种激酶的催化区域有 62％－ 64％的氨基酸同源性，在结构和功能上亲缘关系最近，而且 SnRK1 是 CDPK/SnRK 家族中唯一与酵母和哺乳动物有同源性的成员。

第一个被报道的植物 SnRK1 基因是从黑麦胚乳中分离的 RKIN1[7]，它编码 一个大约 57710 道尔顿，由 502 个氨基酸残基组成的蛋白质随后，人们又克隆 得到了大量的 SnRK1 基因：拟南芥中（AKIN10，AKIN11）, 水稻（RSK1） ，烟 草（NPK5） ，大麦(BKIN2 和 BKIN12)，燕麦（ASPK1，ASPK2 以及 ASPK3） ， 马铃薯（PKIN1） ，甜菜（SBKIN154）等植物的 SnRK1 基因都有很高的氨基 拟南芥 AKIN11 基因的克隆、定位以及功能分析 4 酸相似性，其中最低的两个蛋白质的同源性都达到 68％，通过对大麦，马铃薯 以及拟南芥中 SnRK1 的研究，研究发现：大麦的 SnRK1 亚族由 10－20 个基因 组成， 而马铃薯的 SnRK1 亚族由 5－10 个基因组成， 相比之下， 拟南芥的 SnRK1 亚族只有两个基因对比分析拟南芥的 AKIN10、大麦的 BKIN12 以及马铃薯的 PKIN1 基因的全长 DNA 序列，发现它们的编码区有很高的相似性，但是内含子 的相似性却不高[8]分析从大麦中克隆得到的 SnRK1 基因的 cDNA 序列，可以 将它们分为 BKIN2 和 BKIN12 两个族[9]。

比较 BKIN2 和 BKIN12 的氨基酸序列， 发现它们有 68％的相似性但是从已知的植物 SnRK1 进化树分析，BKIN2 与燕 麦的 ASPK2、 ASPK3 以及所有的双子叶植物的 SnRK1 处于同一分支， 而 BKIN12 基因与燕麦的 ASPK1，黑麦的 RKIN1 以及水稻的 RSK1 处于同一分支两者的 主要不同在于蛋白质的 C 末端（蛋白质相互作用的功能区域） Northern 分析表 明，在整个大麦植株中都可以检测到 BKIN2 基因，而 BKIN12 只可在胚乳中才 能被检测到[10]，水稻的 RSK1 也只能在胚乳中检测到[11]相比之下，拟南芥的 AKIN10 [12], 马铃薯的 PKIN1 [13] 以及烟草的 NPK5 [14]都能在整个植株中被检测 到，它们与 BKIN2 有相同的基因表达模式通过对基因的表达模式以及氨基酸序 列的分析，我们可以将植物的 SnRK1 分成两大类：由 BKIN2, ASPK2, ASPK3 和 双子叶植物的 SnRK1 组成的 SnRK1a 和由 ASPK1, RKIN1 和 RSK1 组成的 SnRK1b，需要说明的是，SnRK1b 基因只存在于谷类植物中。

SnRK1 基因家族主要是通过分析纯化 SAMS 缩氨酸(His Met Arg Ser Ala Met Ser Gly Leu His Leu Val Lys Arg Arg)发现SAMS 缩氨酸是小鼠肝脏 AMPK 的 特异性底物乙酰辅酶 A 的主要磷酸化位点[15],后来被用来检测植物提取物中激酶 的活性利用 SAMS 缩氨酸检测从花椰菜、鹅梨树、马铃薯、胡萝卜以及豆类 植物的叶片、果实、块茎以及种子中提取的活性物质，纯化这些活性物质发现它 们与哺乳动物的 AMPK 非常相似 由于花椰菜的 SnRK1 基因与 AMPK 在磷酸化 哺乳动物 HMG-CoA 还原酶时具有相同。