抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备与.doc

抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备与　　黄清松，罗深秋，林元藻，曾位森　　免疫球蛋白(iunglbulin)是具有抗体活性的一种糖蛋白，主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中人血浆内的免疫球蛋白可分为5类，即免疫球蛋白G〔IgG〕、免疫球蛋白A〔IgA〕、免疫球蛋白〔Ig〕、免疫球蛋白D〔IgD〕和免疫球蛋白E〔IgE〕,其中IgG是最主要的免疫球蛋白而母鸡血液中的免疫球蛋白可传递到鸡卵黄中，并且在鸡发育过程中起保护作用，此种免疫球蛋白称为鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)［1］IgG是存在于鸡卵黄中的主要免疫球蛋白,而Ig和IgA那么主要存在于血清蛋白中［2］IgY属多克隆抗体，多克隆抗体在疾病的诊断和防治方面具有许多特定优点，通常一次性大量制备是相当困难的，而屡次制备又导致抗体的均一性差母鸡一经免疫应答后，可从其卵黄中不断获得特异性的抗体IgY纯度高、特异性强，不会像其他哺乳动物产生的抗体那样会发生穿插血清反响或过敏反响,因此它是最平安的生物制剂，可替代免疫小鼠、豚鼠或兔等哺乳动物所制备的抗体而大量消费近年来，IgY的研究和应用是免疫学领域的热点和非常活泼的课题。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是引起院内感染的重要致病菌，其致病性强，对多种抗菌药物耐药，在治疗上非常棘手本文用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作为抗原免疫母鸡制备了抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IgY［3，4］，并对其理化性质和生物学活性进展了研究，旨在为其以后的诊断和防治应用奠定基矗　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物Leghrn鸡，25周龄，购于华南农业大学实验动物中心，合格证号：2022A025，常规饲养　　1.1.3菌种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(RSA标准菌株AT25923)获自中国药品生物制品鉴定所　　1.2方法　　1.2.1免疫抗原的制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌经接种，摇瓶传代扩大培养后，搜集RSA，用生理盐水反复洗涤3次，离心搜集置于0.4%〔φ〕的甲醛溶液中，于37℃24h灭活，用pH7.0的0.01l/LPBS缓冲液洗涤3次，将菌液调成2×109/L备用取等量的菌液和不完全福氏佐剂(羊毛脂∶液体石蜡=7∶3)混合，每毫升混合液中参加卡介苗2.5L，充分乳化后作为免疫抗原备用　　1.2.2母鸡免疫12只产蛋母鸡随机分成实验组和对照组,每组6只实验组每只每次注射1L免疫原，同时注射4个部位:双翅膀皮下和左右背部皮下注射，每周1次，连续注射3周。

免疫后第16天测定鸡血清IgG效价(1∶2000)，第21天开场拣取免疫蛋对照组用一样方法注射生理盐水以后每月强化免疫1次　　1.2.3抗RSA卵黄免疫球蛋白(IgY)的别离和纯化采用改进水稀释法(D)［5］步骤如下：①打蛋别离搜集蛋黄液②以6倍双蒸水稀释蛋黄液，调节pH值为5.5，4℃冰箱放置过夜③离心，弃去沉淀搜集上清液④盐析：上清液中参加硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达45%，置4℃冰箱静置8h⑤离心，弃去上清液，沉淀物按每毫升卵黄液加5LPBS缓冲液(0.01l/L，pH7.0)溶解⑥透析：将溶解液装入透析袋对蒸馏水透析除NH4+，最后一次改用对PBS缓冲液透析⑦透析液除菌过滤，即得IgY提取液　　1.2.4IgY的抗原性鉴定用esternblt免疫印迹法，二抗为HRP酶标兔抗鸡IgG　　1.2.5IgY的含量测定采用260n和280n双波长紫外分光光度法取2只小试管，甲管参加1.5LIgY提取液、1.5L蒸馏水，乙管参加3L蒸馏水，测定样品在280n、260n的吸收值计算公式：提取液中IgY浓度〔g/L〕=1.45A280-0.74A260　　1.2.7IgY的稳定性测定用ELISA法。

　　1.2.7.1IgY提取液的预处理热处理：分别于25、37、50、60、70、80℃水浴内处理15in酸碱处理：分别置于pH1～14，室温处理3h　　２结果与分析　　2.1IgY的抗原性蛋黄提取物和鸡血清经免疫印迹试验，显示二者均在高分子量附近出现单一的特异性酶染色条带，说明卵黄提取物和鸡血清中目的条带均为鸡IgG分子，具有一样的抗原性说明卵黄中的IgY为鸡血清中IgG传输而来，并且鸡血清中的IgG与IgY分子量一样有报道［7，8］鸡血清IgG分子量为180kD，由67～70kD的重链和22～30kD的轻链形成四聚体IgY中的重链有4个稳定区，而哺乳动物IgG的重链只有3稳定区，IgY多出的一个稳定区为绞链区　　2.2IgY含量提取液经280n和260n波长测定出蛋白的含量平均为13.83g/L蛋黄液转贴于论文联盟.ll.　　1-2:蛋黄IgY;3-4:鸡血清IgG　　图1IgY抗体免疫印迹〔略〕　　Fig.1esternbltfIgY　　1-2:鸡血清IgY;3-4:鸡蛋黄IgY　　2.4温度对IgY稳定性的影响以温度为横轴，ELISA吸光值为纵轴，各温度热处理后的吸光值见图4从曲线中可以看出，在低于65℃时，IgY具有较良好的热稳定性，IgY活性下降甚微。

超过65℃时IgY活性开场明显下降，超过70℃时IgY的活性迅速丧失　　2.5pH对IgY稳定性的影响IgY经不同pH条件处理后的抗原结合活性见图5在pH4时，IgY活性下降较微，在pH4～11范围内，IgY活性几乎不受影响；在pH11后活性开场下降，在pH12时，IgY迅速失去活性说明IgY具有较强的耐酸碱性，在中性、弱酸、弱碱环境中非常稳定　　图4IgY的热稳定性〔略〕　　Fig.4HeatstabilityfIgY　　图5IgY的酸碱稳定性〔略〕　　Fig.5pHstabilityfIgY　　3讨论通常应用于研究和诊断的多克隆抗体,传统方法是从免疫哺乳动物(特别是兔子)的血液中别离提龋如今也可以从免疫母鸡所产蛋的蛋黄中获取，这种技术替代传统的采血技术消费抗体，不仅可获取更有效的抗体，而且对动物的应激也最校利用免疫母鸡消费多克隆抗体IgY的过程称为IgY技术，包含母鸡饲养、免疫过程、产蛋搜集、IgY别离提取等程序［9］目前IgY消费技术上的问题已经得到克制，方法简单实用本研究提取出的RSAIgY，实验证实具有良好的耐热、耐酸碱的理化特性IgY抗体平安环保、来源丰富、造价低、抗体含量高、特异性强，可作为诊断试剂应用于早期、快速、灵敏诊断疾病或感染。

耐甲氧西林的金色葡萄球菌(RSA)，其致病性强，在全球范围内感染率不断增加,成为包括泌尿系统在内的各种感染的重要致病菌之一，也是引起院内感染的重要致病菌［10］临床上，将万古霉素作为治疗RSA感染的首选药物，但万古霉素有较强的不良反响，且随着RSA感染的迅速增加和万古霉素的用量增加，已出现了对万古霉素产生耐药的RSA［11］，因此在治疗上非常棘手抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IgY有可能为临床治疗RSA感染提供新的手段，具有一定的应用前景　　【参考文献】［1］任平国,徐启红.鸡卵黄免疫球蛋白〔IgY〕别离纯化的研究［J］.现代食品科技,2022,23〔11〕：24-26.　　［2］江千舟.鸡卵黄免疫球蛋白〔IgY〕的别离、纯化方法研究进展［J］.国外医学：预防、诊断、治疗生物制品分册，2000，23〔4〕：168-171.　　［4］HANSENP,SBLEJA.Islatinandpurifiatinfiunglbulinsfrhikeneggsusingthiphiliinteratinhratgraphy［J］.JIunlethds,1998,215(1-2):1.　　［6］宋宏新,刘玄,染艳.鸡卵黄免疫球蛋白的别离制备研究［J］.食品科学，2022,26〔4〕:51-54.　　［7］尹红章,李秀华,王兵,等.应用鸡卵细胞大量制备多克隆抗体［J］.中国生物制品杂志,1993,16(4):167.　　［8］杨婷婷.鸡卵黄抗体(IgY)的提取及其在医学上的应用［J］.中国人畜共患病杂志,2000,16(3):76.　　［9］彭玉麟,呙于明.鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽消费中的应用前景［J］.中国饲料，2002,10(6):26-28.　　［10］李囡,范红,陆小军,等.新型多重聚合酶链反响对耐甲氧西林金色葡萄球菌Se基因的分型研究［J］.现代检验医学杂志，2022,23〔1〕:32-35.　　［11］闻平,俞晓丽,陈蕾,等.黄芩素对耐甲氧西林金色葡萄球菌的体外抗菌活性研究［J］.抗感染药学，2022,4〔4〕:161-163.转贴于论文联盟.ll.。