孔雀绿染料的微生物脱色研究_成文.pdf

应用与环境生物学报? 2000,6( 4) :370~ 373?? Chin J Appl Environ Biol= ISSN1006- 687X?2000?08 ?25?收稿日期: 2000?03 ?01? ? 接受日期: 2000 ?06 ?23* 香港裘槎基金(The Croucher Foundation) 资助项目孔雀绿染料的微生物脱色研究*成 ? 文 ? ? 曾宝强1( 华南师范大学水处理研究开发中心? 广州? 510631;1香港教育学院科学系? 香港)摘? 要? 从印染废水处理池的活性污泥中分离到五株对孔雀绿染料有脱色能力的细菌, 其中编号为 3# 的菌株人苍白杆菌( Ochrobactrum anthropi) 的脱色能力较强. 对 3# 菌株的脱色反应条件进行初步研究表明, 3# 细菌的脱色反应的 pH 为 5~ 11, 最佳范围 pH 6~ 7; 温度 10~ 30? , 最佳温度 30? ; 有氧气情况下的脱色效果较缺氧情况下好; 在最佳条件下该菌对孔雀绿染料的脱色作用较强, 处理 4、 12、 24 h 后, 色度去除率分别达到 50% 以上、 70% 以上和 90%以上. 图 4 表 3 参 15关键词? 孔雀绿染料; 微生物脱色CLC? X791 ? X172MICROBIAL DECOLORATIORIZATION OF MALACHITE GREENCHENG Wen1Department of Science, HongKong Institute of Educational, Hongkong)Abstract ?Five strains of bacteria, with decoloring capability for malachite green, were is olatedfrom the ac ? tivated sludge of dyeing wastewater treatment pond. Among them, strain 3# , Ochrobactrum anthropi, wasdemonstratedwith best decoloring capability. The results from the study on the decoloring conditions of strain 3# showed that the pH range for decoloring reaction was 5~ 11 with 6~ 7 being the optimum, the temperaturerange was 10~ 30? with 30?being efficiency optimal. The decoloring efficiency was higher under the pres?ence of oxygen than that lack of oxygen. Strain 3#couldmore strongly decolor malachite green under optimumconditions. The decoloring rate was above 50% , 70% and 90% in 4, 12 and 24 h treatment, respectively.Fig 4, Tab 3, Ref 15Keywords? malachite green; microbial decolorationCLC? X791 ? X172随着染料工业的迅速发展, 染料的品种和数量日益增加, 全世界每年以废物形式向周围环境排放的染料约 60 000 t[1]. 染料中的孔雀绿广泛用于真丝、 羊毛、 皮革、 麻制品、 陶瓷制品、 棉布等的染色, 同时在很早就作为杀菌剂、 杀虫剂、 消毒剂用于水产养殖业[ 2~ 5].孔雀绿在浓度低至 0. 1 mg/L 对哺乳动物细胞都是高毒性的, 能促进肝脏肿瘤的形成以及导致小白兔和鱼的异常增殖[2, 6]. 孔雀绿会在可食用的鱼组织中存在相当长时间, 并且孔雀绿与致癌的三苯甲烷染料的结构相同[ 2, 7,8], 因而这种物质在陆地和水生生态系统中的生物积累对环境和人类健康两方面的都有影响[ 2].从染料制造、 纺织、 印染以及渔业等排出的废水中都含有该种污染物, 引起水体的大面积污染, 因而孔雀绿的污染早就引起了关注. 但现有一些资料表明, 除了有报道[ 3]肠道细菌能将孔雀绿染料还原为孔雀绿的无色体外, 未见有研究报道能分离出用于孔雀绿染料废水生物处理的细菌. 本研究正是试图从各种来源的污泥中分离出能对该染料脱色或者分解该染料的细菌, 将孔雀绿染料由三苯甲烷染料[ 9, 10]的复杂有机物分解成简单有机物, 消除或降低孔雀绿染料的危害, 并且研究这些细菌的最适生长条件, 为孔雀绿染料废水生物处理技术的工业应用打下理论基础.1 ? 试验方法1. 1 ? 污泥样品与染料从广州某印染厂的废水处理生化池中采集的生物膜和污泥样品两个; Malachite green( crystals, for mi?croscopy, 最大吸收波长 617 nm).1. 2 ? 脱色菌的分离培养基成份: 牛肉膏 1 g, 酵母膏 2 g, 蛋白胨 5 g, 氯化钠 5 g, 蒸馏水 1 000 mL, pH 7. 4 0. 2, 在 p= 0. 98MPa, 121? 灭菌 20 min. 富集培养基加20mg/L 燃料, 固体培养基加 1. 5% 的琼脂.从印染厂的废水处理生化池中采集的生物膜和污泥样品两个, 将样品分别接入富集培养基中, 在恒温培养箱中培养. 经过 5 代的驯化培养后, 在固体培养基平板上经过多次划线分离获得单株菌落[ 11]. 分别测定各菌株对染料的脱色能力. 选择脱色能力强、 脱色速度快的优良脱色菌进行鉴定.1. 3 ? 细菌鉴定分离出的脱色菌经纯化后, 采用 Biolog GN MicroplateTM 方法并对照伯杰氏细菌鉴定手册( 第八版)及相关文献[12, 13]进行鉴定.1. 4 ? 脱色能力的测定细菌的脱色能力用比色法测定, 即把反应液经离心机10 000 r/min 的速度离心 20min 除去菌体, 将上清液用UV- vis在孔雀绿的最大波长( ?= 617 nm)处比色测定, 得到上清液的浓度 A1, 以及不加菌的反应液的浓度A0, 根据脱色率 p= (A0- A1)/A0! 100% 的计算公式进行脱色率能力试验[ 14].2 ? 结果与讨论2. 1 ? 脱色细菌的分离与鉴定通过用富集培养基进行五代的驯化培养, 然后在固体培养基上经过多次划线分离, 得到 11 株对孔雀绿染料有脱色能力的细菌, 对其中 5 株脱色能力较强的菌株, 采用 BiologTM 方法进行鉴定. 结果表明这 5 株脱色菌分属于 4个属: 假单胞菌属( Pseudomonas) ( 8# ) 、 产碱菌属(Alcaligenes) (11# )、 不动杆菌属(Acinetobacter) (9# )、 人苍白杆菌( Ochrobactrum anthropi) (3# )、 人苍白杆菌( Ochrobactrum anthropi) (1# ).2. 2 ? 不同菌株对染料的脱色能力将不同的菌株接种于液体培养基、 30? 恒温培养箱里培养 24 h 的细菌悬液调整至吸光度 A540nm= 0. 4, 取8 mL 菌液, 加 100 mg/L 的染料 2mL, 使染料浓度为 20mg/L, pH 7. 0, 放在温度为 30? 的恒温培养箱里, 测定静置培养24 h 的脱色能力. 图 1 表明: 五种菌株对孔雀绿染料都能起脱色作用, 脱色率都高于 60% 以上. 但不同菌株脱色能力是不同的, 其中 3# ( Ochrobactrum anthropi)的脱色能力较高, 脱色率达 75. 6% , 而 8#和 11# 菌的脱色能力相对较弱, 只有 65% 左右, 9# 和 1# 菌的脱色率接近 70% .2. 3 ? 细菌对染料的脱色特性pH、 温度、 氧气是细菌生长的 3个重要因素, 研究这 3个因素对细菌生长、 脱色的影响, 对用生物法处理含孔雀绿染料的废水有重要的指导意义. 选择脱色能力最强的 3# 菌进行脱色条件的研究.2. 3. 1? pH 对细菌脱色的影响? ? 将接种于液体培养基、 30? 恒温培养箱里培养 24 h的细菌悬液调整至吸光度 A540nm= 0. 4, 取 8 mL 菌液, 加 100 mg/L 的染料 2 mL, 使染料最终浓度为 20 mg/L, 用 1 mol/L HCl 或 1 mol/LNaOH 调整至不同的 pH 值, 以不加细菌的溶液为空白, 在 30? 的培养箱里静置培养 24 h, 然后进行脱色能力的测定.图2 表明, pH 值在 6~ 7之间, 其脱色率最高, 达 98% 以上, pH 值在5~ 10 之间都表现较强的脱色能力, 其脱色率大于 60% , pH 值在低于 4 或高于 11时, 脱色率很低, 小于 35% . 同时, 在研究中还发现, 细菌在脱色过程中对溶液的 pH 也有较大影响. 从表 1 可见, 当开始时溶液的 pH> 7 时, 经过细菌的作用后, 能使 pH 值上3714 期成? 文等: 孔雀绿染料的微生物脱色研究? ?升; 当开始时溶液 pH> 9 时, 经过细菌的作用后, 能使 pH 值下降, 而且溶液开始时 pH 值越高, 使其改变的 pH值越大; 即无论溶液是酸性或碱性, 最终使溶液向趋于中性的方向改变, 起到调整废水 pH 值的作用. 由此可见, 该细菌的最适 pH 范围为 pH 6~ 7. 其作用的耐受 pH 值为 5~ 10, 甚至到 pH 11, 即在生化处理孔雀绿染料废水时其 pH 值最好能控制在 5~ 10, 不超过 pH 11.图 1? 不同菌株对染料的脱色率( rD/ % ) Fig. 1? Effects of different bacteria on dye decoloration图 2? pH 值对细菌脱色的影响 Fig. 2? Effect of pH on bacteria decoloration表1? 细菌在脱色过程中对溶液 pH 的影响Table 1? Effect of bacteria on solution pH during decolorationpH04. 04. 96.07.08. 09. 010. 0 11. 0pH24 h4. 15.57.67. 88. 18. 48. 69. 02. 3. 2? 温度对脱色的影响? ? 在液体培养基中接入 3# 菌, 30? 的恒温培养箱里培养 24 h, 然后调整细菌浓度至吸光度A= 1. 0( ? = 540 nm) , 取 6 mL 菌液, 加 50!10- 6染料 4 mL 至最终染料浓度为 20! 10- 6, pH 7. 0.在不同温度下的恒温培养箱里静置培养 24 h, 之后取出离心, 比色. 图 3 表明, 温度对细菌脱色的影响非常显著, 在温度低于 10? 时, 脱色率很低, 温度在15? 时,脱色率提高到 50% 以上, 温度在 30? 时, 脱色率达到73% , 温度更高时, 脱色率降低, 45? 时脱色率在 50%左右. 即细菌脱色的最佳温度在 30? , 15~ 40? 时, 脱色率大于 50% .图 3? 不同温度对脱色率( rD/ % ) 的影响 Fig. 3? Effect of different temperatures on decoloration2. 3. 3? 氧气对细菌脱色的影响? ? 在不同营养水平下, 研究氧气对微生物脱色的影响. 在液体培养基中接入 3# 菌, 30? 的恒温培养箱里培养 24 h, 然后调整细菌浓度至吸光度 A540nm= 1. 0,。