细菌耐药表型的检测方法.ppt

细菌耐药表型的检测方法 细菌耐药表型的检测细菌耐药表型的检测 一、一、β-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测（（1）头孢硝基噻吩显色法（）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸）：制配纸片片→灭菌水湿润灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上，涂测试菌于纸片上，10min观察观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观内观察）2）酸度法：青霉素）酸度法：青霉素→β-内酰胺酶水解内酰胺酶水解→青霉酸、青霉酸、以下以下→酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液）变为酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液）变为黄色3）碘测定法：）碘测定法：β-内酰胺酶破坏内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与内酰胺环，碘与破坏后的破坏后的β-内酰胺结合，使兰色的淀粉内酰胺结合，使兰色的淀粉—碘复合物碘复合物转变成无色转变成无色4）仪器测定法：）仪器测定法：Vitek、、Microscan的药物测试卡的药物测试卡中均带有检酶功能中均带有检酶功能 二、二、ESBLS检测检测（（1））纸纸片片扩扩散散初初筛筛：：头头孢孢他他啶啶（（30μg/片片））抑菌圈抑菌圈≤22mm 头孢噻肟（头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈片）抑菌圈≤27mm 头孢曲松（头孢曲松（30μg/片）抑菌圈片）抑菌圈≤25mm 氨曲南（氨曲南（30μg/片）抑菌圈片）抑菌圈≤27mm（（2））肉肉汤汤稀稀释释法法：：上上述述药药物物MIC≥2μg/ml可可疑疑为为ESBLS。

表表型型确确证证试试验验：：对对2个个任任何何一一个个药药物物MIC，，在在加加克克位位维维酸酸比比不不加加克克拉拉维维酸酸的的MIC值值降降低低3个个以以上上对对倍倍稀稀释释度度判判为为ESBLS） （（3）双纸片协同确认试验：）双纸片协同确认试验：头头孢孢他他啶啶（（30μg/片片））与与头头孢孢他他啶啶（（30μg））/克克位位维维酸（酸（10μg））头头孢孢噻噻肟肟（（30μg/片片））与与头头孢孢噻噻肟肟（（30μg））/克克拉拉维维酸（酸（10μg）两纸片抑菌圈相比）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为即为ESBLS4））E-test法法（（浓浓度度梯梯度度法法））：：由由瑞瑞典典AB Biodisk公公司司研研究究生生产产，，广广洲洲贝贝肯肯公公司司经经销销试试条条中中的的三三代代头孢菌素或氨曲南的头孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑为即可疑为ESBLS（（ 5）） 仪仪 器器 测测 定定 法法 ：： Vitek,microscan和和 BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试微生物分析仪均可测试ESBLS6））利利用用分分子子生生物物学学技技术术（（PCR、、DNA探探针针等等））及及分分析析酶酶底底物物谱谱及及抑抑制制物物谱谱、、生生物物化化学学技技术术等等检检测技术可对测技术可对ESBLS做出确诊。

做出确诊 三、三、Ampc酶检测酶检测1.初筛：初筛：（（1））头头孢孢西西汀汀（（30μg/片片））与与头头孢孢西西汀汀（（30μg））/邻邻氯氯西西林林（（200μg）后者比前者的抑菌圈）后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为即疑为Ampc2））5种种纸纸片片筛筛选选：：马马斯斯平平、、泰泰能能、、头头孢孢西西汀汀、、头头孢孢他他啶啶与与头头孢孢他他啶啶/克克拉拉维维酸酸如如头头孢孢西西汀汀≤18mm，，对对马马斯斯平平、、泰泰能能敏敏感感即即疑疑为为产产Ampc，，如如头头孢孢他他啶啶与与其其酶酶抑抑制制剂剂的的抑抑菌菌圈圈≥5mm可能产可能产ESBLS2.确认试验（头孢西汀三维水相试验法）确认试验（头孢西汀三维水相试验法）AmpC酶新的检测方法酶新的检测方法3.三维水相试验方法的改进三维水相试验方法的改进（1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在距纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育18-24h。

3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性※三维水相试验方法的改进三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).AmpC酶新的检测方法酶新的检测方法4.质粒型质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测酶三联纸片方法的检测（1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， ，）3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性 四、金属四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法内酰胺酶的表型检测方法1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA)（1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸，35℃孵育18-24h3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金属β-内酰胺酶金属金属β-内酰胺酶的表型检测方法内酰胺酶的表型检测方法2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA)（1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。

2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚胺培南纸片中心处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性，即产金属β-内酰胺酶五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证（（2009年）年）1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必要再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R”的药物），但主要以感染控制为目的检验该酶2.什么是碳青霉烯酶？一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶，如：KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）.v碳青霉烯类抗生素－Doripenem（目前无CLSI折点）－厄他培南－亚胺培南－美洛培南3.肠杆菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶筛选的折点＊亚胺培南不用于变形/普罗威登/摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选因为这些菌属会产 生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查）4.什么时候做改良Hodge试验？v如果头孢噻肟、头孢他啶和 /或头孢曲松全部“R” v注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。

v MIC（μg/ml) 抑菌圈(mm)v 厄他培南 2 19-21v 亚胺培南＊ 2-4 NA ＊＊v 美洛培南 2-4 16-215.做改良的Hodge试验（确证试验）（1）ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释2）用棉签满涂布于MH平板上，就像纸片扩散法药敏试验一样，在中心加一张厄他培南或美洛培南（最好）纸片3）取待测菌（1－3号）从纸片边缘向外划（用1μl接种环）4）35℃培养过夜后，观察结果5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生6.改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的表型试验，在检测KPC方面有>90％的敏感性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/特异性不定（如：低水平的金属酶）7. 改良Hodge试验的质量控制(2009年CLSI:M100-S19.APPB.124)： 随患者菌株每天检测。

1）改良Hodge试验阳性菌株: 肺克ATCC BAA-1705 （2） 改良Hodge试验阴性菌株：肺克ATCC BAA-1706六、六、D-Test试验试验（1）将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上2）在M-H平上板贴一片红霉素 (15ug/片) 纸片，在距纸片边缘处贴克林霉素 (2ug/片) 纸片3）35℃孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性D-Test试验耐药表型判断试验耐药表型判断耐药机制 红霉素 克林霉素 基因型――――――――――――――――――――――― 泵出(MS) R S MSRA核糖体基因诱导变异 (iMls) R D-Test(+) （ermC为主）核糖体基因结构变异 (cMLS) R R （ermA为主）―――――――――――――――――――――－－七、其它耐药表型检测七、其它耐药表型检测，MRCNS4.泵出机制：美平/泰能（MIC）≥1。