燕麦抗冻蛋白的分离纯化及对冻藏面团品质的影响.docx

燕麦抗冻蛋白的分离纯化及对冻藏面团品质的影响抗冻蛋白 (AFP)是一种对冰晶的生长和重结晶有抑制作用的特殊蛋白质 , 具有热滞效应 (THA)、抑制重结晶效应 (RI) 、修饰冰晶形态效应三个基本特征由于其具有阻止冰晶生长、抑制冰晶重结晶而使生命有机体免受结冰破坏的特点 ,AFPs 有望在冷冻食品的保鲜方面发挥重大作用 , 成为一种有前景的冷冻食品添加剂本文从冷诱导的燕麦籽粒中分离纯化得到一种新型的植物抗冻蛋白 (AsAFP),经序列鉴定后对其性质进行预测与分析 ; 利用同源建模对 AsAFP进行三维结构的模建 , 对 AsAFP和冰晶面复合物进行分子动力学模拟 , 通过分子模拟技术分析其抗冻机理 , 为抗冻蛋白的研究实验提供了理论指导 ; 并将 AsAFPs应用于冷冻面团及湿面筋蛋白中 , 对冻藏过程中冷冻面团的理化特性和最终馒头制品的质构 , 以及湿面筋蛋白的聚集行为、 冻融特性、理化特性等进行了研究 论文首先从冷诱导的燕麦籽粒中经过一系列的分离纯化步骤 , 得到电泳纯的 AsAFP,热滞活性为1.24 C, 通过 MALDI-TOF-MS/MS法进行序列鉴定 , 并对其氨基酸组成、等电点及相对分子质量、二级结构及表面溶剂可及性等进行了预测和分析。

结果表明 :AsAFP的氨基酸序列为 VSSVISSSLF EKMLLHRGFY TYDAFIAAAKSFPAFATTGS TDVRKREVAA FLAQTSHETT GGWPTAPDGP YELGSTSDYF GRGPIQISYNYNYGAAGKAI GVDLLRNPDL VTSDNTVEFK TALWFWMTPQ SPKPSSHDVI TGRWSPSSTDKAAGRVPGYGVLTNIIDGGVECGKGQESHVADRIGYYKDNLDCYNQKPFA,与 Endochitinase具有最大匹配度 ;AsAFP具有高亲水性氨基酸残基比例 ; 其理论等电点为 6.08, 相对分子质量为 21728.18; 二级结构中含有大量的无规则结构 , 富含α - 螺旋结构 ,且具有较高的表面溶剂可及性以 AsAFP氨基酸序列为探针 , 对 AsAFP进行同源建模 , 将模建的蛋白与不同冰晶面进行对接 , 计算结合能量 , 并对 AsAFP和冰晶层复合物进行分子动力学模拟4DWX被认为是 AsAFP的同源建模最佳模板 , 序列一致性达 63%,序列覆盖度达100%;以 4DWX的三维结构为模板 , 采用 modeller 9.14 单模板建模并进行结构优化 , 构建出准确性较高的 AsAFP模型 ; 以分子对接方法预测 AsAFP和冰晶层复合物的结合模型 , 对接结果的分析发现 ,AsAFP 的遥爪结构 ( 由 Helix 和 loop 组成 ) 是其与冰晶结合的主要位点 , 氢键作用和疏水相互作用在 AsAFP和冰晶层的稳定结合中起到关键的作用 ,Asn 、Arg 和 Ser 等氨基酸残基参与形成氢键 ; 对 AsAFP和冰晶层复合物进行分子动力学模拟 , 分子动力学数据表明 ,AsAFP 和冰晶层在动力学模拟过程中表现出很好的稳定性 , 随着时间的推移 , 回转半径、氢键数量、二级结构和溶剂可及表面保持平衡 , 进一步说明了 AsAFP-冰晶层复合物结合的紧密 ; 由于 AsAFP与 Prism 型晶面在动力学模拟过程中产生的氢键数量最大 , 结合稳定性最优 , 使其表现出的抗冻性更高。

将 AsAFPs添加到冷冻面团中 , 研究了冻藏过程中 AsAFPs对冷冻面团的影响研究表明 : 冻藏过程引起了面团体系可冻结水含量的增加 , 而 AsAFPs的亲水性使其可以吸附在自由水附近 , 限制水分的自由移动 , 从而显著减缓可冻结水含量增加的幅度 , 而可冻结水含量决定了面团在冻藏过程中冰晶形成的数量 , 因此AsAFPs可以有效抑制冻藏过程中面团体系冰晶的形成 ;AsAFPs 的存在可以降低面团水分流动性 , 抑制冻藏过程中强结合水的流失 ; 降低冻藏过程中冷冻面团 G’和 G’的下降趋势 , 增强冷冻面团的产气和持气能力 , 提高酵母菌的存活率 , 保护面筋网络结构 ; 提高馒头最终品质 , 使馒头制品更柔软 , 提高馒头制品的黏聚性和回弹性将 AsAFPs添加到面筋蛋白中 , 研究了冻藏过程中 AsAFPs对面筋蛋白的影响对面筋蛋白、麦谷蛋白、麦醇溶蛋白聚集行为的研究表明 : 冻藏过程中 , 面筋蛋白和麦谷蛋白中的 GMP随着冻藏时间的延长发生了不同程度的解聚 , 麦醇溶蛋白分子量分布范围发生改变 AsAFPs的加入可以通过抑制冰晶形成和重结晶 , 减少冻结及冻藏对面筋网络的破坏 , 保护面筋蛋白在冻藏过程中免受冰晶形成所造成的机械破坏 , 从而减缓面筋蛋白和麦谷蛋白的解聚 , 减小麦醇溶蛋白在冻藏过程中造成的机械损伤 ;SDS-PAGE电泳研究发现 , 冻藏对还原后的面筋蛋白和麦谷蛋白亚基并无影响 ; 但面筋蛋白、麦谷蛋白、麦醇溶蛋白的自由巯基含量均有所增加 , 可见冻藏过程中二硫键的断裂是导致高聚物发生解聚的主要原因。

AsAFPs的添加可以减少二硫键的断裂 , 降低自由巯基含量的增加 对面筋蛋白冻融特性的研究表明 : 对新鲜面筋蛋白而言 ,AsAFPs 的添加可以增大面筋蛋白的熔融温度区间 , 降低面筋蛋白样品的熔融焓和可冻结水含量 , 提高玻璃化转变温度 ; 而对于冷冻面筋蛋白 ,AsAFPs 的添加可以降低水分流动性、熔融焓和可冻结水含量 ; 对面筋蛋白流变学性质、二级结构和微观性质的研究表明 :AsAFPs 可以减缓冻藏过程中冷冻面筋蛋白 G’和 G’的下降趋势 , 保护面筋蛋白的α - 螺旋和β - 折叠结构免受冰晶损伤 , 保护面筋网络结构 。