生物化学实验2014.9modify.doc

农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海1实验一 氨基酸、蛋白质的主要化学性质一、目的用实验方法验证氨基酸、蛋白质的主要化学性质，增强感性认识二、原理α—氨基酸和蛋白质均含有 α—氨基酰基 R—CH—C—的结构，故都能与水 合| ||NH2 O 茚三酮作用生成兰紫色物质OC OH CC OHO+R CH COOHNH2OC CHOHC O+NH3pH5100¡ æ+R CHO CO2++NH3OC CHOHC O+OHO CCHO COOC CC OOCCCON+3H2OOC CC OOCCCONONH4C CC OOCCCON- +£¨À¶×Ï É«£©Ë® ºÏ Ü áÈýÍ ªNH3脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放氨而直接生成黄色化合物 蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故在碱性环境中能与硫酸铜结合 成紫红色的络合物，此反应称为双缩脲反应。

2农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海2蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，当其与浓硝酸 共热时，则变成黄色，这就是黄蛋白反应，若再继续加碱则颜色转变成橘黄色 若蛋白质分子中具有含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸等，则与碱及醋酸铅共热 时，分解而产生硫离子，后者遇铅盐即生成黑色硫化铅沉淀 蛋白质胶体是亲水胶体，若除去其质点上的水膜和电荷，蛋白质粒子则凝聚析 出，这就是蛋白质的沉淀作用，使蛋白质胶体沉淀的方法有多种，常用的有下列几 种： 1、 盐析法： 加中性盐或硫酸铵等电解质试剂于蛋白质溶液中，这些电解质离子的水化能力 比蛋白质强，可以夺去蛋白质粒子外围的水膜，并且蛋白质粒子外围的双电层又受 到了压缩，也就是使其所带的电荷削弱，蛋白质胶体粒子由于失去两种使自己稳定 的因素而沉淀 2、 有机溶剂的沉淀作用： 水溶性的有机溶剂如乙醇、丙酮等，它们与水的亲和力大于蛋白质，因此能破 坏蛋白质粒子的水膜，而使其沉淀析出 3、生物碱试剂的沉淀反应： 生物碱沉淀剂如三氯醋酸、若味酸、鞣酸等都能与蛋白质阳离子结成不溶性的 盐而沉淀析出 4、重金属离子的沉淀作用： 某些重金属离子，如 Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等，能与蛋白质阴离子结合成不 溶性盐类而沉淀析出。

三、实验试剂与器材（一）试剂 1%甘氨酸、5%蛋白质溶液、0.25%茚三酮水溶液、10%NaOH、1%硫酸铜、浓 硝酸、2%醋酸铅、饱和硫酸铵溶液、95%乙醇、10%鞣酸溶液、饱和苦味酸 （二）器材 电炉、烧杯、试管四、操作步骤1、茚三酮反应 在两支试管中，分别加入甘氨酸 1ml 和 5%蛋白质溶液 1ml，然后各加入 0.25%茚 三酮水溶液 10 滴，将试管放入沸水中加热几分钟，观察现象 2、双缩脲反应 向存有 1ml 5%蛋白质溶液的试管中，加入 10% NaOH 10 滴充分摇匀，逐滴 加入 1%CuSO4数滴，观察试管中的颜色变化 注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色 Cu(OH)2，防碍此颜色反应的观察 3、黄蛋白反应农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海3向一支盛有 0.5ml 5%蛋白质溶液的试管中加入浓硝酸 4 滴，并加热，观察有何 现象出现？然后再加入 10% NaOH 1ml，观察有何变化？ 4、蛋白质中硫的鉴定 取头发几根或指甲少许，并加 10%NaOH 2ml 于试管内，煮沸 2 分钟，冷却后 加入 3～4 滴 2%Pb(Ac)2溶液，观察其现象，说明头发或指甲中有什么样的结构存 在。

5、盐析作用 取 5%蛋白质溶液 1ml 于试管中，加入饱和硫酸铵溶液 2ml，有何现象产生？ 再向试管中加入 6ml 左右的蒸馏水，振荡后又有何变化？ 6、有机溶剂的沉淀作用 取 5%蛋白质溶液 1ml 于试管中，再加 95%乙醇 2ml，充分混合，观察有无沉 淀析出 7、生物碱试剂的沉淀作用 取 2 支试管，各加 5%蛋白质溶液 1ml，分别滴加 10%鞣酸溶液 5 滴，饱和苦 味酸 5 滴，有何现象产生？ 8、重金属离子的沉淀作用 取 2 支试管，各加 5%蛋白质溶液 1ml，分别加入 2%Pb(Ac)2，1%CuSO4各 5 滴，观察现象五、思考题1、蛋白质和氨基酸共同具有哪种颜色反应？为什么？2、哪种颜色反应可以用来检验蛋白质是否完全水解？农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海4实验二 蛋白质的两性反应一、目的了解蛋白质的两性性质二、原理蛋白质是由氨基酸所组成的，虽然绝大多数氨基酸的氨基与羧基已结合成为肽 键，但是，总有一定数量的自由氨基与自由羧基，以及酚基、巯基、胍基和咪唑基 等酸碱基团因此，蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，具有两性反应调节溶 液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷与负电荷相等，以 兼性离子状态COO-PrNH2COO-PrNH3+COOHPrNH3+H+OH-H+OH-Ò õÀë×Ó ¼ æ Ð Ô Àë×Ó Ñ ôÀë×ÓpH >pI pH =pI pH pI pH =pI pH

若配制体积相等的一系列不同 pH 值的缓冲溶液，在其中各加入等量的某蛋白 质溶液，混匀后静置一段时间，观察并比较各管的混浊度，可知最混浊的那个试管 中溶液 pH 即是该蛋白质的等电点三、实验试剂与器材（一）试剂： 1、0.5%酪蛋白的醋酸钠溶液，取纯酪蛋白 0.25g 置于 50ml 容量瓶中，加水约 20ml 及 1 mol·L－1 NaOH 5ml，待酪蛋白完全溶解后，加入 1 mol·L－1醋酸 5ml，用水稀释到 50ml，混匀，或将酪蛋白溶于 0.1 mol·L－1 NaAc 溶液中 2、0.10 mol·L－1 HAcCOO-NH+3农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海73、0.01 mol·L－1 HAc 4、1.00 mol·L－1 HAc（二）器材： 1、试管 2、试管架 3、移液管 1ml 2ml 5ml四、操作步骤1、取直径相似的干燥试管 5 支，按下表准确加入各种试剂： 试 管 编 号12345 加 入 试 剂 (ml)蒸馏水 1.00 mol·L－1 HAc 0.10 mol·L－1 HAc 0.01 mol·L－1 HAc 酪蛋白醋酸钠溶液2.4 1.61.0- - 4.01.03.0 - 1.01.01.5 -2.5 1.03.4 -0.6 1.0 溶液最终 pH3.54.14.75.35.9 混浊度加毕摇匀，即配成不同氢离子浓度的缓冲液，各管内溶液的 pH 如表中所示。

静置约 30 分钟，观察各试管溶液的混浊度，以—、+、++、+++表示之 注：该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确，实验中应严格按照定 量分析的要求和操作进行 根据实验观察结果，指出酪蛋白达到其等电点时溶液的 pH 值，并说明其原因五、思考题1、在蛋白质两性反应及酪蛋白等电点测定这两个实验中所用的酪蛋白溶液是 不同的，它们有何区别？能否将它们对调使用？为什么？农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海8实验四 葡聚糖凝胶色谱一、目的要求掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶色谱的原理和方法二、原理凝胶色谱是以被分离物质的分子量差异为基础的一种色谱方法这种色谱的固 定相是具有多孔、网状结构的颗粒状凝胶所吸附的液体，不同型号的色谱凝胶，其 网孔的大小是不同的能分离的物质量范围也就不同，色谱时一般根据欲分离物质 的大小及工作目的来选择一定孔径的凝胶装柱，于柱上端加待分离的混合物，然后 用蒸馏水或其他稀溶液（即流动相，也叫洗脱剂）洗柱时，由于各物质分子大小和 形状不一而得到分离，大分子物质先随洗脱剂流出柱，小分子物质最后流出色谱柱 关于凝胶色谱的机理有许多假说和理论，目前为人们普通接受的理论是分子筛效应， 如下图所示：凝胶色谱的简单原理甲：待分离的混合液上柱，于色谱床表面， （○代表大分子物质，·代表小分子物质，代表凝胶。

）乙：当样品随溶剂沿色谱床往下移动时，大分子物质因位阻效应，随溶剂流动，而小分子物质渗入凝胶颗粒内丙：大分子物质行程短，已流出色谱床，小分子物质尚在行进中由上图可以清楚地看出，分子量大的物质不能进入凝胶的网孔；完全被排阻在 凝胶颗粒之外而随洗脱液在凝胶颗粒之间流动，因此，流程短，移动速度快，最先 流出色谱柱，分子量小的物质可自由进入网孔而渗入到凝胶颗粒内部，因此，流程 长，移动速度慢，最后多色谱柱中流出，而分子大小介于上述二者之间的各物质都 能不同程度地渗入凝胶颗粒，因此，它们在二者之间依次流出色谱法，由此就达到 了分离的目的由于这一过程可以把大小分子分开，犹如过滤、过筛所以凝胶色农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海9谱又叫凝胶过滤，分子筛色谱由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，凝胶色谱 也称阻滞扩散色谱，排阻色谱等 目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶（商品名称为 Sephadex） 、聚丙烯酰胶凝胶（商 品名称为 Biogel）以及琼脂糖凝胶（商品名称为 Sepharose） 此外尚有这些凝胶的 各类衍生物 葡聚糖凝胶是色谱凝胶中应用最广泛的一种，是由一定平均分子量的葡聚糖 （以 α-1，6 糖苷键连接的右旋糖苷）与甘油基以醚桥（ ）形成相互交联形成三维空间的网状结构，成为水不溶性物质，交联度的大小可在 合成时控制交联剂（一般为环氧氯丙烷）和葡聚糖的比例及反应条件来掌握，交联 度大的则“网眼”小，反之，则“网眼大” 。

“网眼”的大小决定了被分离物质能够 自由出入凝胶内部的分子量范围葡聚糖凝胶的基本结构OCH2CHCH2OOH农农信１３０１信１３０１ 黄海黄海10葡聚糖凝胶的理化性质可概括为五性，即多孔性、亲水性、不溶性、稳定性和 电中性 目前市售的葡聚糖凝胶都是珠状的，不同型号的葡聚糖凝胶用 G 表示（如 G- 25、G-200 等） ，G 后面的数字为凝胶的吸水量（毫升水/克干胶乘以 10 得到的数） ， 如 G-25 即表示此型号凝胶的吸水量是 2.5 毫升/克干胶即标号=持水量×10，标号 大说明交联度小、吸水量大，也就是说凝胶的“网眼”大凝胶色谱可分离的分子 量范围从几百到数十万不等进行工作时一般根据欲分离物质的分子大小及工作目 的来选择合适的葡聚糖凝胶装色谱柱三、实验器材与试剂1．实验器材 色谱柱（1.2×20cm） （×1） ，吸量管 1ml（×1） ，刻度离心管（×4） ，小试管 （1×7.5cm） （×20） ，烧杯 50 毫升（×1） 、100 毫升（×2） ，灯泡瓶（×1） ，滴 管，葡聚糖凝胶 G-50（Sephadex G-50） 2．试剂 兰色葡聚糖 2000（分子量 200 万以上，兰色） ，铬酸钾（分子量 194，黄色） ， 洗脱剂为蒸馏水。

四、方法与步骤1．凝胶溶胀 称取 3 克 Sephadex G-50 加入到 50 毫升蒸馏水内，室温溶胀 6 小时或沸水溶 胀 2 小时，一般常用后一种方法沸水浴溶胀不但节约时间，而且可以消毒，还能 除去凝胶中污染的细胞和排除凝胶内的气泡，溶胀应该彻底，否则会影响色谱的均 匀性，凝胶溶胀后用倾泌法除去凝胶上层水及细小颗粒，反复以蒸馏水洗涤直至无 细小颗粒止（细小颗粒的存在会影响色谱的流速） ，然后将浸泡后的凝胶抽干，用 。