免疫细胞的分离和保存技术.docx

免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测 定，是观察机体免疫状态的一种重要手段为此，须将各种参与免疫反应的细 胞从血液或脏器中分离出来参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细 胞、中性粒细胞等由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也 异有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其 中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其 亚群分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高 活力的细胞现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘 附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗 原和受体加以选择性分离 一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600〜1000:1,两者的比重不同其沉降 速 度 亦 异 ， 通 常 用 两 种 方 法 加 以 分 离 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用 肝素抗凝法肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤 维蛋白而防止血液凝固操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温 30〜 60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细 胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后 加入少量蒸馏水或含氯化铵的 Gey 溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂 解 ， 经 过 反 复 洗 涤 可 得 纯 度 较 高 的 白 细 胞 悬 液 。

二 ） 聚 合 物 加 速 沉 淀 法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone, PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与 白细胞分离本法的细胞获得率比自然沉降法高二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他 细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为 1.090 左右，而淋巴细胞和单核 细胞密度为 1.075〜1.090，血小板为 1.030〜1.035为此利用一种密度介于 1.075〜1.092 之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度 的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离常用的分层液有 Ficoll 和 Percoll 两种一） Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法 聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖 聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透 压、无毒性的特点高浓度的 Ficoll 溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用 60g/L 的低浓度溶液，密度为 1.020，添加比重为 1.200 的泛影葡胺（ urografin） 以增加密度。

国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层 液，将适量 340g/L 泛影葡胺加入 Ficoll 溶液中即可配制成密度合适分层液分 离人外周淋巴细胞以密度为 1.077±0.001 的分层液最佳，因为人的红细胞密度为 1.093,粒细胞密度为1.092,单个核细胞在1.076〜1.090之间而不同动物血 中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为 1.088，马为 1.090 分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以 Hanks 液或 PBS 液作适当 稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面水平式离心 后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图 20-1）1稀無的血液<—稀释的血竣J-单亍核细胞红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到 Ficoll 而凝集成串钱状而 沉积于管底血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单 个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤 高心重悬本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占 90％〜95％，细 胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25°C时会影响细胞获得率。

二） Percoll分层液法这是一种连续密度梯度离心分离法Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮（PVP） 处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密 度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化用Percoll原液（密度1.135）与约等 量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底 到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加 在液面上，低速离心后，便得四个细胞层表层为死细胞残片和血小板，底层 为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞（75%），下层富含淋巴 细胞（98%）（图-2）该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法，但操作 流程较长，手续较多k死细胞组分4富含单核细胞的组分〜富含诽巴细胸的组分—红細胞七粒细胞组分图-2连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图三、淋巴细胞及其亚群的分离为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍 如下一）、纯淋巴细胞群的采集通常利用单核细胞在37°C和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、 尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去 除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。

1）粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37C 温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群因B细胞也 有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失2） 吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexGlO的柱层 中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的 细胞主要是淋巴细胞此法简单易行，对细胞极少损害3） 磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3“m的羰基 铁颗粒，置37°C温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用 磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞二）、淋巴细胞亚群的分离分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术其原则是根据 相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化凡根据细胞的特性和标志选择 纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的 细胞是为阴性选择常用以下几种方法：（1） E花环沉降法本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环 后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。

浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富 含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围 的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞2） 尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B 细胞分开操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填 在内径5〜6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将 单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1〜2h用预温的含10%〜20%小牛 血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残 留的T细胞再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B 细胞如此得到的T细胞纯度在90%以上，B细胞纯度可达80%3）亲和板结合分离法利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的 抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则 与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3）同 样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细 胞淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除 细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。

如要分离CD4+或CD8+细胞，则可 用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附用抗Ig抗体则可分离B细胞同样，用活 化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞图-3亲和分离法图解（4）荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分 组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理 系统，④细胞分选系统其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系 统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定当细胞从流动室喷嘴处流出 时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小 滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照 射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处 理，分辨细胞的类型如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带 电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管（图-4）用FACS分离 细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少 用于常规，而多数仅作为研究的手段。

样品J 熒光横涮器图-4荧光激活细胞分离仪简图四、 吞噬细胞的分离和收集人外周血中单核一巨噬细胞可通过Pecoll密度梯度分离法获取，但数量较 少，用血量多用斑蝥敷贴法可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作 进一步体外分离，细胞量损失较少该法是用滤纸蘸取10%中药斑蝥酒精浸出 液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸 取疱中的组织液，内含巨噬细胞但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起 局部感染，应慎用欲获取小鼠、大鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡 油，3〜4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70%〜80%为巨噬细胞五、 淋巴细胞的保存和活力测定（一） 、分离细胞的保存在某些情况下，分离所得细胞需要加以保存，否则活力迅速下降，甚至死 亡1） 短期保存技术将分离到的细胞用适量含10%〜20%灭活小牛血清的 Hanks、Tc-199、 RPMI1640或其他培养液稀释重悬所用培养液要求等渗，具缓冲作用，并对 细胞无毒性通常置4°C保存较好，可减低细胞代谢活动要注意不要迅速改 变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克2） 长期冷冻保存技术利用液氮深低温（一196C ）环境保存细胞，是当前世界上通用的细胞长期 保存技术。

其原理在于深低温环境可中断细胞的代谢，但在降温过程由于冰晶 的形成和渗透压的改变均可导致细胞的损伤和部分死亡，所以在冷冻过程中一 定要加用冷冻保护剂，常用的保护剂为二甲亚砜（dimethylsulfoxide， DMSO ）冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很 大影响条件合适时，冻存细胞一旦复苏，恢复37C培养，其形态和代谢活动 均可恢复正常操作的原则是先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后， 取沉积细胞用含10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于 冻存管内，速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤继而进行降 温冷冻，目前常用两步降温法，即迅速降温至一选择好的临界温作为过渡站， 如一80 C低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放 入液氮中如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的。