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第四章第四章 免疫球蛋白免疫球蛋白抗体（抗体（Antibody, Ab)是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能与相应抗原特异性结合，具有免疫功能的球蛋白免疫球蛋白（免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig)：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白 分泌型：存在于体液中，具有抗体的各种功能  膜型：B细胞膜上的抗原受体 Ab=Ig,Ig≠Ab；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；第一节第一节 基本概念基本概念第二节第二节 免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构一一 、、IgIg的基本结构的基本结构（一）、重链和轻链（一）、重链和轻链（一）、重链和轻链（一）、重链和轻链                  IgIgIg的的的两条长链两条长链两条长链称为称为称为重链重链重链（（（Heavy chain, HHeavy chain, HHeavy chain, H链）链）链）, , ,                  含含含          450-550aa450-550aa450-550aa，分子量为，分子量为，分子量为50-75kD50-75kD50-75kD。

重链可分为重链可分为重链可分为μ μ μ、、、γ γ γ、、、α α α、、、δ δ δ、、、ε ε ε链链链                                    IgIgIg的的的两条短链两条短链两条短链称为轻链称为轻链称为轻链（（（Light chain, LLight chain, LLight chain, L链）链）链）        含含含214aa214aa214aa，分子量为，分子量为，分子量为25kD25kD25kD可分为κ κ κ和和和λ λ λ型     IgM IgG IgA IgD IgE （二）可变区和恒定区（二）可变区和恒定区 １.可变区：可变区：重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区（variable region,V区）；  VH和和VL 2.恒定区恒定区：：靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(constant region, C区)；CH（CH1、CH2、CH3和CH4 ）和CL.•高变区（高变区（hypervariable region，，HVR）：）：   氨基酸组成和排列顺序特别易变化   VH或VL各3个高变区：HVR1、HVR2和HVR3•骨架区（骨架区（framework region,FR））   高变区之外的区域。

   VH和VL各有四个骨架区，  FR1、FR2、FR3和FR4表示•互补性决定区互补性决定区（complementarity-determining region，CDRCDR）： VH和VL的3个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，故高变区又被称为互补性决定区（三）免疫球蛋白的功能区（三）免疫球蛋白的功能区1．定义：Ig的H链、L链每隔110110个氨基酸个氨基酸由链内二硫键接构成一个能行使特定功能的球形结构，称为Ig的功能区•L链功能区：2个，（VL，CL各一个）•H链功能区：IgG，IgA，IgD，4个（V区1个，C区3个）, IgM，IgE，5个（V区1个，C区4个）•铰链区：位于CH1、CH2之间V V区区区区C区区VL+VHVL+VH区：区：区：区：抗原结合部位（抗原结合部位（抗原结合部位（抗原结合部位（2 2个）个）个）个）CH3CH3区区区区：是：是：是：是IgIg与多种与多种与多种与多种细胞细胞细胞细胞FcFc受体结合的部受体结合的部受体结合的部受体结合的部位位位位. .CLCL和和和和CHCH 区区区区：具有同种：具有同种：具有同种：具有同种异型抗体的遗传标记。

异型抗体的遗传标记异型抗体的遗传标记异型抗体的遗传标记2 2个）个）个）个）CH2CH2区区区区：：：：IgGIgG的补体结的补体结的补体结的补体结合点和通过胎盘的部位合点和通过胎盘的部位合点和通过胎盘的部位合点和通过胎盘的部位2.功能区的作用功能区的作用铰链区：铰链区：赋予弹性赋予弹性和伸展性和伸展性. .二、二、IgIg的其他结构的其他结构（（一）连接链（J链）：富含半胱氨酸得多肽链 由浆细胞合成的一种糖蛋白 IgA和IgM含有J链 可稳定Ig多聚体的成份（二）分泌片 是分泌型IgA(sIgA）的一个辅助成分， 为一种糖肽，由粘膜上皮细胞合成和分泌       介导IgA二聚体的转运 保护sIgA的铰链区免受蛋白酶的水解破坏   J 链链分泌片分泌片sIgA三 Ig的酶解片断1.木瓜蛋白酶 2个FabFab 段：结合抗原 1个FcFc段：结合细胞2.胃蛋白酶F(ab’)段:双价抗体活性pFc’段：无生物学活性第三节免疫球蛋白的生物学活性第三节免疫球蛋白的生物学活性   1．．1.1.特特异异性性结结合合抗抗原原, ,清清除除病病原原微微生生物物 ；； 2. 2.激活补体（激活补体（IgGIgG、、IgMIgM）；）；3 3．与多种细胞表面．与多种细胞表面FcFc受体结合；受体结合；（1）调理作用（opsonization)：IgG、IgM•指抗体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。

 （2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)：IgG、IgA、IgE•指表达Fc受体的细胞（ NK细胞、吞噬细胞)通过与抗体Fc段结合直接杀伤被抗体包被的靶细胞 （3）I型超敏反应：IgE 与肥大细胞、嗜碱性粒细胞Fc受体结合，促使其合成和释放生物活性物质四、穿过胎盘四、穿过胎盘 IgG所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要原因，主要借助胎盘滋养层细胞表面的原因，主要借助胎盘滋养层细胞表面的Fc R进进行的五、免疫调节五、免疫调节 第三节第三节 五类五类IgIg的主要特性的主要特性 一、IgG（一） 特性1、存在形式：单体，占血清Ig总量的3/42、合成时期：婴儿出生后三个月开始合成3、半衰期：23天，是所有抗体中半衰期最长的二） 生物活性1、是主要的抗感染抗体    2、是补体经典激活途径参与者3、是唯一可以穿过胎盘的抗体4、具有调理作用和介导ADCC效应的功能IgGIgG 分分分分 子子子子 的的的的 四四四四 种种种种 亚亚亚亚 型型型型IgG1IgG1IgG4IgG4IgG3IgG3IgG2IgG2 四种亚类的四种亚类的四种亚类的四种亚类的IgGIgGIgGIgG分子在血清中的分子在血清中的分子在血清中的分子在血清中的浓度不同，所发浓度不同，所发浓度不同，所发浓度不同，所发挥的生物学特性挥的生物学特性挥的生物学特性挥的生物学特性亦不相同。

亦不相同亦不相同亦不相同二、二、IgM（一）特性1、存在形式：五聚体，占血清Ig总量的10%，是分子量最大分子量最大抗体 mIgM 是是 BCR 2、合成时期：胎儿晚期已能合成，最早合成和初次免疫应答中最早出现的抗体3、半衰期：5天，（三） 生物活性1、具有强大的调理、激活补体及杀菌作用 3、不能介导ADCC效应4、ABO血型天然抗体IgMIgM J J J J 链链链链IgM IgM 抗抗抗抗 体体体体 结结结结 构构构构分分分分 泌泌泌泌 型型型型 IgMIgM膜膜膜膜 型型型型 IgMIgMsIgMsIgM IgIga a a a IgIgb b b b IgIga a a a IgIgb b b b三、三、IgA（一） 特性：1、存在形式：单体（血清型）和双体（分泌型）；其中分泌型分泌型主要分布于呼吸道、消化道及初乳等分泌液中2、合成时期：婴儿在出生4~6个月才能合成IgA二） 生物活性1、是机体局部粘膜防御感染局部粘膜防御感染的重要因素（分泌型IgA）。

2、具有中和毒素作用（血清型IgA）3、辅助婴儿抵抗呼吸道、消化道感染（初乳中含分泌型IgA） 四、四、IgDIgD（一） 特性1、存在形式：单聚体，仅占血清Ig总量的1%2、合成时期：较晚 3.半衰期：3天（二） 生物活性1、成熟B细胞的重要表面标志2、血清中IgD的功能尚不清楚五、五、IgEIgE（一） 特性1、存在形式：单聚体，仅占血清Ig总量的0.002%2、合成时期：最晚合成的抗体三） 生物活性1、引发ⅠⅠ型过敏反应型过敏反应2、抗寄生虫的主要抗体第四节第四节IgIg的基因及抗体的多样性的基因及抗体的多样性一、Ig的基因结构 1.Ig轻链基因结构（1）Ig κ型轻链基因：Vκ、Jκ、Cκ 小鼠：350 5 1 人：100 5 1（2）Igλ型轻链基因：Vλ、Jλ、Cλ 小鼠：2 4 4 人：2 6 62. Ig重链的基因结构               V、D、J、C小鼠：300-1000   20     4       8                                  人： 75-250    30    6      11   二、Ig基因重排•由于Ig基因成簇存在，编码完整的功能性Ig多肽链必须通过基因重排。

 重链重链重链重链胚系胚系胚系胚系基因基因基因基因重链重链重链重链基因基因基因基因重排重排重排重排初始初始初始初始RNARNA转录转录转录转录mRNAmRNA新合成多新合成多新合成多新合成多肽肽肽肽轻轻链链基基因因的的重重排排、、R RN NA A处处理理和和蛋蛋白白质质表表达达的的过过程程(二)抗体多样性机制: 1.组合多样性：Ig基因库中众多V、D、J、C基因家族成员极端多样性的排列组合；2.连接多样性：基因重排过程中可出现不同的连接点； 3.体细胞突变：已成熟的B细胞受抗原刺激后，在发育过程中重排基因所发生的突变4. L链H链相互随机配对多肽链基因片段数V区基因重组方式重排和随机配对后推算的多样性数目V D JH链1000 12 4V-D-J48000κ链250 - 4V-J1000小鼠Ig多样性（举例）第五节第五节 抗体的应用抗体的应用——免疫学检测免疫学检测•免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法•具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点•特异性•抗原抗体反应的可见性•适当的比例和浓度•可逆性应应 用用1、利用已知抗原检测未知抗体、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。

2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等2、利用已知抗体检测未知抗原、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原;抗原或抗体的检测方法抗原或抗体的检测方法 ¨凝集反应凝集反应¨沉淀反应沉淀反应¨免疫标记技术免疫标记技术 （（一）凝集反应（一）凝集反应（agglutinationagglutination）） 颗颗颗颗粒粒粒粒性性性性抗抗抗抗原原原原（（（（红红红红细细细细胞胞胞胞、、、、细细细细菌菌菌菌等等等等））））与与与与抗抗抗抗体体体体特特特特异异异异性结合，形成肉眼可见的凝集块性结合，形成肉眼可见的凝集块性结合，形成肉眼可见的凝集块性结合，形成肉眼可见的凝集块1 1 、直接凝集、直接凝集、直接凝集、直接凝集(direct agglutination(direct agglutination) ) 玻片凝集、试管凝集玻片凝集、试管凝集玻片凝集、试管凝集玻片凝集、试管凝集细菌的鉴定和血型的检查细菌的鉴定和血型的检查一、一、 传统免疫分析传统免疫分析2、间接凝集（、间接凝集（indirect agglutination）））） 可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应相应相应相应 抗体混合出现的凝集现象。

抗体混合出现的凝集现象抗体混合出现的凝集现象抗体混合出现的凝集现象检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体（二）沉淀反应（（二）沉淀反应（precipitationprecipitation）） 可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组（免疫球蛋白、细胞裂解物、组（免疫球蛋白、细胞裂解物、组（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，织浸液等）与相应抗体结合，织浸液等）与相应抗体结合，织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫形成不溶性免疫形成不溶性免疫形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物复合物，出现不透明的沉淀物复合物，出现不透明的沉淀物复合物，出现不透明的沉淀物多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀 免疫比浊法免疫比浊法免疫比浊法免疫比浊法1 1、单向免疫扩散（、单向免疫扩散（、单向免疫扩散（、单向免疫扩散（single immunodiffusionsingle immunodiffusion）：）：）：）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。

扩散，为一种半定量试验扩散，为一种半定量试验扩散，为一种半定量试验 环的直径与环的直径与环的直径与环的直径与抗原含量成抗原含量成抗原含量成抗原含量成正相关正相关正相关正相关2、双向免疫扩散（、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）：）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析一致一致一致一致部分一致部分一致部分一致部分一致不一致，有多种成分不一致，有多种成分不一致，有多种成分不一致，有多种成分3 3、免疫电泳（、免疫电泳（、免疫电泳（、免疫电泳（immunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis））））常用于血清蛋白种类分析，以观察常用于血清蛋白种类分析，以观察常用于血清蛋白种类分析，以观察常用于血清蛋白种类分析，以观察IgIg的异常增多或缺失的异常增多或缺失的异常增多或缺失的异常增多或缺失                                                   1 1）简易免疫电泳）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线， 2 2）对流免疫电泳）对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术3 3）火箭免疫电泳）火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。

可定量分析 用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性荧光素荧光素荧光素荧光素 ：：：：异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素： 125125I I、、、、131131I I酶：酶：酶：酶：辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（IFAIFA））））放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（RIARIA））））酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（EIAEIA）））） 二、二、现代免疫分析现代免疫分析- -免疫标记技术免疫标记技术1．抗体制备．抗体制备•多克隆抗体•单克隆抗体，2 2．标记物与标记方法。

．标记物与标记方法   放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统免疫分析基本环节免疫分析基本环节 3．分析方式设计：．分析方式设计：非竞争方式、竞争方式；直接法、间接法；标记抗原、标记抗体；均相、非均相4.4.信号检测信号检测与相应的标记物对应主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法 （一）、放射免疫分析（一）、放射免疫分析 ( (Radioimmunoassay RIA) ) 利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术特点： 灵敏度高、特异性强、样品用量少灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测1.放射免疫分析必需的基本试剂：放射免疫分析必需的基本试剂：•抗抗体体：：作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白•标标记记药药物物：：提供可检测的信号(响应值)（放射性）•非非标标记记药药物物：：在标准曲线制备时是药物标准品，在样品中则为被测药物•分离剂分离剂——分离结合与游离部分结合相游离相2. 2.基基基基本本本本原原原原理理理理：：：：RIARIA是是标标记记抗抗原原和和未未标标记记抗抗原原对对有有限量抗体限量抗体的竞争性结合。

的竞争性结合标记药物(S*)+抗体(Ab)          [标记药物-抗体]复合物(S*-Ab)       F*                P-B*            B*    F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度，它们可通过产生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)            非标记药物（S）            F                       +标记药物(S*)+抗体(Ab)          [标记药物-抗体]复合物(S*-Ab)   F*                      P-B-B*            B*      [非标记药物-抗体复合物](S-Ab)                                 B•随着S的加入，它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用，表现为使B*减少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有对应的F*和B*信号强度值，因此可建立S量(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系，作成剂量反应曲线免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图3.3.标准曲线的绘制与样品测定步骤标准曲线的绘制与样品测定步骤1.取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5－8个系列浓度。

2.加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要3.加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求4.将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)5.5.加入分离剂，加入分离剂，使结合部分使结合部分(B)(B)与游离部分与游离部分(F)(F)分离6.6.测定各管测定各管结合部分或游离部分的计数率结合部分或游离部分的计数率7.7.标准曲线通常以标准抗原标准曲线通常以标准抗原( (待测药物标准品待测药物标准品) )的浓度为的浓度为横坐标，以结合率横坐标，以结合率(B(B％％) )为纵坐标作图为纵坐标作图 纵坐标纵坐标B B％的计算：将与抗体结合的标记药物的放％的计算：将与抗体结合的标记药物的放射性强度射性强度(B)(B)与加入的标记药物总放射性强度与加入的标记药物总放射性强度(T)(T)比较，比较，即即B B％％=(B=(B／／T)×100T)×100％；％；例：例：125125I I－－RIA(DCCRIA(DCC沉淀法沉淀法) )测定血清中地高辛测定血清中地高辛浓度浓度 待测血清样品待测血清样品待测血清样品待测血清样品50μl→50μl→50μl→50μl→样品管中样品管中样品管中样品管中; ; ; ;含不同浓度地高辛标含不同浓度地高辛标含不同浓度地高辛标含不同浓度地高辛标准品的血清准品的血清准品的血清准品的血清50μl→50μl→50μl→50μl→标准曲线各管中标准曲线各管中标准曲线各管中标准曲线各管中;50μl ;50μl ;50μl ;50μl 空白人血清空白人血清空白人血清空白人血清→→→→零标准管零标准管零标准管零标准管. . . .各管中依次加入保温液各管中依次加入保温液各管中依次加入保温液各管中依次加入保温液100μl→100μl→100μl→100μl→抗体溶液抗体溶液抗体溶液抗体溶液100μl→100μl→100μl→100μl→125125125125I I I I标记的地高辛标记的地高辛标记的地高辛标记的地高辛( ( ( (溶液溶液溶液溶液)100μl)100μl)100μl)100μl摇匀摇匀摇匀摇匀→→→→在室温在室温在室温在室温(15(15(15(15～～～～25℃)25℃)25℃)25℃)放置放置放置放置30min→γ-30min→γ-30min→γ-30min→γ-计数器测定各管的总计数计数器测定各管的总计数计数器测定各管的总计数计数器测定各管的总计数T T T T( ( ( (即加人的协即加人的协即加人的协即加人的协I I I I总放射性剂量总放射性剂量总放射性剂量总放射性剂量)→)→)→)→在电磁搅拌在电磁搅拌在电磁搅拌在电磁搅拌( ( ( (或手摇或手摇或手摇或手摇) ) ) )下，下，下，下，迅速向各管内加人迅速向各管内加人迅速向各管内加人迅速向各管内加人1ml1ml1ml1ml工作液工作液工作液工作液( ( ( (全部加完控制在全部加完控制在全部加完控制在全部加完控制在5min5min5min5min内内内内) ) ) )，，，，摇匀摇匀摇匀摇匀→→→→离心离心离心离心10min(3000r/min)→10min(3000r/min)→10min(3000r/min)→10min(3000r/min)→倾去上清液倾去上清液倾去上清液倾去上清液→→→→γ-γ-γ-γ-计数器计数器计数器计数器测定各管中沉淀的计数测定各管中沉淀的计数测定各管中沉淀的计数测定各管中沉淀的计数F(F(F(F(游离协游离协游离协游离协I I I I地高辛放射性强度地高辛放射性强度地高辛放射性强度地高辛放射性强度)→)→)→)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。

计算出标准曲线各管和样品各管的结合率计算出标准曲线各管和样品各管的结合率计算出标准曲线各管和样品各管的结合率 （二）酶免疫分析（（二）酶免疫分析（enzyme immunoassay）               标标记记物物为为酶酶，，酶本身并不能直接产生信号，必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应，从而引起吸收光谱等的变化供测定      常常用用的的酶酶为为：： 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、β-半乳糖苷酶 酶酶 底底 物物显色反应显色反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,2‘- -连胺基连胺基-2(3--2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405420 β-β-ＤＤ- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450420 1. 均均相相酶酶免免疫疫分分析析，，EMITEMIT法法（（enzyme multipled immunoassay technique））   基基本本原原理理：：酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，测定小分子抗原。

酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgE—Ab)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)； 可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法2.2.酶酶 联联 吸吸 附附 免免 疫疫 分分 析析 （（ enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA））•属于非均相免疫分析的代表，普普遍遍应应用用于于各各领领域•基本原理：是将过量抗抗体体（（抗抗原原））包包被被于载体上，通过抗原抗体反应使酶酶标标记记抗抗体体（（抗抗原原））也也结结合合在在载载体体上上，经洗洗涤涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显显色色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术1 1）双抗体夹心法）双抗体夹心法Ø方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色Ø应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体—待测抗原待测抗原—酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定2 2）间接法）间接法方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体应用： 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体123 3）竞争法）竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。

加底物显色 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA试剂盒试剂盒（三）胶体金免疫快速检测法（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法双抗体夹心法-大分子抗原大分子抗原 样本加到样本加到S S区，进入区，进入B B区和区和B B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到区的金标抗体发生免疫反应，再层析到T T线位置时，如果样本中含有待测抗原，则线位置时，如果样本中含有待测抗原，则T T线不显色或显色很淡，线不显色或显色很淡，C C线显色，线显色，这样得到的是这样得到的是阳性阳性结果当待测样本中不含抗原时，再层结果当待测样本中不含抗原时，再层析到析到T T线位置时，则线位置时，则T T线显色，线显色，C C线也显色线也显色，得到，得到阴性阴性结果结果SBTCD2.2.竞争抑制法竞争抑制法                                     能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗多种病毒的抗体或抗原，如抗多种病毒的抗体或抗原，如抗多种病毒的抗体或抗原，如抗HIVHIV抗体的检测。

抗体的检测抗体的检测抗体的检测四）免疫印迹法（四）免疫印迹法第五节第五节 抗体生成技术抗体生成技术整体水平抗体生成技术整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体组合抗体库技术组合抗体库技术   噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术  Ig  Ig基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术一、多克隆抗体一、多克隆抗体（（polyclonal antibody）） 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物是多种抗体的混合物,  , 它是由多种抗原决定簇刺激它是由多种抗原决定簇刺激多株多株B B细胞增殖分化所产生的细胞增殖分化所产生的,  , 称为多克隆抗体称为多克隆抗体. .存在问题存在问题特异性差特异性差,   ,  用于免疫学检测容易出现交叉反应用于免疫学检测容易出现交叉反应           传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 23412341 234脾脾脾脾 脏脏脏脏淋巴結淋巴結淋巴結淋巴結B B B B 細胞細胞細胞細胞制备过程制备过程 传统传统传统传统抗血清的交叉反抗血清的交叉反抗血清的交叉反抗血清的交叉反应应应应专一性反应专一性反应专一性反应专一性反应沒有反應沒有反應沒有反應沒有反應交叉反应交叉反应交叉反应交叉反应+-? 1 2 3 1 2 3 Ag AAg A x y z x y z Ag BAg B 1 1’ ’ 2 0 2 0 Ag AAg A’ ’1 12 23 31 12 23 31 12 23 3 二、单克隆抗体二、单克隆抗体（（monoclonal antibody）） 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.可生可生产产有用抗有用抗体体的的 淋巴細胞淋巴細胞 若若与与 癌癌细细胞胞融合，融合，则则形成形成稳稳定而可培定而可培养养的的细细胞胞株株。

癌细胞可培养生长浆细胞B cell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個個 B cell 只只产产生一生一种种抗抗体体 抗体-a-b-c-d-a        -b      -c      -d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和 脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫 抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集 B 細胞免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次Ag X制备过程制备过程-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEG     Cell fusion融合瘤细胞d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选单抗传统抗体 (抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性 高度均一性：高度均一性： 纯度很高的均一性抗体纯度很高的均一性抗体 高度专一性：高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定只对抗原分子上某一抗原决定 簇起反应簇起反应 大量产生及稳定性：大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖 之传代之传代  McAb McAb 在治疗中存在的问题（障碍）在治疗中存在的问题（障碍）：1.McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应。

2.完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体组织，达不到有效的治疗浓度解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径—基因工程技术基因工程技术 三、基因工程抗体三、基因工程抗体(Genetic engineering antibody)           根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体   主要包括 嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区可变区与人抗体的与人抗体的恒恒定区融合定区融合而得到的抗体而得到的抗体2人源化抗体人源化抗体(humanized antibody         把鼠抗体的把鼠抗体的CDRCDR序列序列移植到人抗体的移植到人抗体的可变区内可变区内，所得到的，所得到的抗体称抗体称CDRCDR移植抗体或移植抗体或改型抗体改型抗体，也就是，也就是人源化抗体人源化抗体  小分子抗体包括小分子抗体包括FabFab、、FvFv或或ScFvScFv、单域抗体及最小识别、单域抗体及最小识别单位单位等几种。

等几种 3 3 小分子抗体小分子抗体  (1)Fab  (1)Fab 由完整的由完整的轻链和轻链和FdFd组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的1/31/3         FvFv、、ScFvScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/62)Fv 或 ScFv FvFvScFvScFv连接肽连接肽连接肽连接肽 即为即为VHVH，约为完整分子的，约为完整分子的1/121/12它只由一个结构域构成，故称它只由一个结构域构成，故称单单域抗体单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性 (3)单域抗体VHVH4 4 双特异抗体双特异抗体　　双特异性抗体双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)(bispecific antibody,BSAb)是指能同是指能同时识别时识别2 2种抗原的抗体种抗原的抗体抗体融合蛋白抗体融合蛋白        将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，这些融合蛋白能利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性导向特定部位。

     抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗全部抗体的轻、重链可变区基因体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体然后筛选出所需的特异基因和抗体 5 5 抗体库技术抗体库技术•重点掌握1.抗体和免疫球蛋白的概念、2.免疫球蛋白的基本结构、功能区及其功能、3.抗体的生物学活性、•了解：五类免疫球蛋白的特点与功能4.ELISA法的主要类型及基本原理5.胶体金免疫快速检测法的主要类型及基本原理6.多克隆抗体及单克隆抗体 5种免疫球蛋白的划分是根据：（ ）A．H链和L链均不同     B．V区不同      C．L链不同            E．连接H链的二硫键位置和数目不同 下列备选答案中，错误的是:             A.抗体都是免疫球蛋白B.Ig单体分子一般是二价C.一种浆细胞产生的抗体分子与其表面抗原识别受体具有 相同的抗原结合特性D.铰链区连接免疫球蛋白的H链和L链E.超变区位于免疫球蛋白的可变区内D．H链不同能与肥大细胞结合的Ig是：A.IgA     B. IgD                   D. IgG      E. IgMIgG分子中能与巨噬细胞上受体结合的功能区是：A. CL     B. CH1区      C. CH2区与抗原结合后，激活补体能力最强的Ig是A. IgA      B. IgG     C. IgM      D. IgDC. IgED.CH3区E.IgE 用ELISA双抗体夹心法检测血清中甲胎蛋白（AFP），应选择的固相包被物是: （ ） A.已知AFP        B.酶标记AFP                              D.酶标记抗AFP抗体   E.待检血清酶联免疫吸附试验间接法所用的酶标记物是                         A.酶标记抗体       B.酶标记抗补体C3b抗体C.酶标记抗原                           C.抗AFP抗体D.酶标记抗抗体。