生物与化学工程系论文、壳聚糖-银配合物的制备及其抗菌性能研究.doc

1壳聚糖-银配合物的制备及其抗菌性能研究生物与化学工程系 应用化学专业118652008026 林季琳 指导老师 薛丽群【摘要】本文用壳聚糖与硝酸银反应，制备了壳聚糖-银配合物，探讨了配比、温度、反应时间和 pH 等条件对配 合物形成的影响，通过红外光谱对配合物进行结构分析表征研究了壳聚糖-银配合物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌性能结果表明，以壳聚糖对银离子的吸附量为指标，在本实验条件下制备壳聚糖-银配合物的较适宜条件为：0.100g 壳聚糖中加入 25.00mL 0.02mol/L AgNO3，反应温度为 50℃，反应时间为 6h，pH 值为3抗菌实验结果表明，用浓度为 2mg/mL 的壳聚糖-银配合物对大肠杆菌、白色念珠菌和枯草芽孢杆菌均可达到80%左右的抑菌率关键词】壳聚糖；Ag（Ι）离子；配合物；抑菌1.前言自 然 界 中 ， 许 多 微 生 物 是 人 类 及 动 植 物 众 多 疾 病 的 病 原 体 ， 它 们 时 刻 威 胁 着 人 类 的 生 存 与 发展 2003 年 的 SARS 病 毒 全 国 大 面 积 感 染 事 件 ， 2009 年 在 墨 西 哥 引 发 的 “H1N1”流 感 并 感 染 人致 死 等 事 件 ， 这 一 切 都 给 人 们 留 下 了 许 多 思 考 ， 公 共 卫 生 已 引 起 了 各 国 政 府 和 世 界 人 民 的 高 度 关注 。

为 了 人 类 自 身 的 健 康 发 展 ， 改 善 个 人 卫 生 条 件 已 经 成 为 人 们 的 共 识 研 制 高 效 的 抗 菌 剂 对 人们 健 康 水 平 的 提 高 具 有 十 分 重 要 的 意 义 抗 菌 剂 一 般 包 括 无 机 抗 菌 剂 、 有 机 抗 菌 剂 和 天 然 抗 菌 剂 三 种 [1] 无 机 抗 菌 剂 主 要 是 利 用 无 机离 子 (如 银 、 铜 、 锌 、 钛 等 )或 无 机 抗 菌 氧 化 物 来 实 现 杀 菌 或 抑 菌 的 一 类 抗 菌 剂 有 机 抗 菌 剂 主 要成 分 可 分 为 醇 系 、 酚 系 、 醛 系 、 酯 系 、 醚 系 、 过 氧 化 物 系 、 环 氧 化 物 系 、 卤 素 系 等 天 然 抗 菌 剂主 要 是 天 然 动 、 植 物 的 一 些 提 取 物 ，如鱼腥草素、壳聚糖等，人类最早使用的是天然抗菌剂甲壳素是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖，其学名是 β-(1，4) -2-乙酰氨基-2- 脱氧-D-葡萄糖，是由 N-乙酰氨基葡萄糖以 β-1，4 糖苷键缩合而成的壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，一般而言，N- 乙酰基脱去 55%以上的就可称之为壳聚糖，或者说能在 1%乙酸或者 1%盐酸中溶解 1%的脱乙酰甲壳素，这种脱乙酰甲壳素就被称之为壳聚糖 [2]，结构如图 1 所示。

图 1.壳聚糖的结构壳聚糖是一种天然抗菌剂，而且是一种环境友好材料，无毒、无味、可生物降解其主要原料来源于水产加工厂废弃的虾壳和蟹壳壳聚糖呈白色或淡黄色半透明状固体，略有珍珠光泽它具有良好的化学物理性能，能拉丝、成膜、制粒因为壳聚糖分子链上有活性基团，如氨基和羟基，可修饰活化偶联生成各种衍生物，化学修饰包括羟甲基化、羟基化、烷基化、酰基化、硫酸酯化、缩合反应、接枝与交联反应等通过化学修饰作用，在壳聚糖分子结构中引入了各种功能团，改善其物化性质壳聚糖还表现出了止血活性、抗微生物活性、以及与金属离子的强亲和性 [3,4]，在食品、制造、化工、环境保护等方面中的运用受到很大的重视壳聚糖及其衍生物抗菌活性的基础研究受到了广大科 2研学者的关注黎碧娜等 [5]对磺化壳聚糖的抑菌性能进行了研究，认为磺化壳聚糖对大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、黑曲霉、假丝酵母都有抑制作用，并且磺化壳聚糖浓度越高，抑菌效果越好王勇等 [6]将壳聚糖经100Gy 60Co γ－射线辐射处理后，发现其对金黄色葡萄球菌抑菌效果最强 Guo等 [7]合成了不同分子质量的壳聚糖季铵盐，对番茄灰霉病和炭疽病的抗菌效果进行测定发现，壳聚糖季铵盐比壳聚糖具有更强的抗菌性，而且高分子质量的壳聚糖季铵盐的抗菌性强于低分子质量的壳聚糖季铵盐。

研究结果表明壳聚糖及其衍生物的抗菌效果明显，衍生物的抗菌性研究空间更大作为天然抗菌剂的壳聚糖在自然界中含量丰富，杀菌速度快、抑菌效果好，而且具有良好的物理、化学性能和生物相容性，但耐热性能差，大大限制了其应用范围 [8，9] 而无机系抗菌材料中以Ag +效果最好，但是与天然或人工合成的高分子化合物亲和性、相容性较差，并且价格昂贵壳 聚 糖 中 糖 元 的2位 为 －N HCOCH3或 游 离 的 －N H2， 3位 为 仲 －O H和 6位 为 伯 －O H， 这 种 特 殊 的 结 构 使 得 壳 聚 糖对 一 些 金 属 离 子 在 一 定 的 pH值 下 具 有 螯 合 作 用 [10] 赵玉清等 [11]人合成了壳聚糖－Ag(I)，并对其抑菌性研究认为，壳聚糖－银对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用，并且抑菌性能力随配合物中Ag的配位比的增大而增强本 实 验 将 制 备 壳 聚 糖 -银 配合物，将天然抗菌剂与无机抗菌剂进行复配 利 用 壳聚 糖 -银 具 有 创 口 愈 合 和 抑 菌 两 种 特 性 ， 研 究 该 配 合 物 对大肠杆菌、白色念珠菌和枯草杆菌的抑菌性能希望可以找到壳聚糖与Ag 最佳的配比，并且得到的产物对这三种常见的菌有明显的抑菌性，使这种材料可以更好的应用在人们的生活中。

2.实验部分2.1 实验仪器与药品2.1.1 药品与试剂壳聚糖，浙江澳兴生物科技有限公司，脱乙酰度≥85%，相对分子质量 1.8×106；NaCl，天津市化学试剂研究所，工作基准试剂；AgNO 3，上海申博化工有限公司，分析纯；冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司，分析纯；HNO 3，分析纯；30％NaOH，广西西陇化工厂汕头公司，分析纯；蛋白胨，上海化学试剂采购供应站中心化工厂；牛肉膏，北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖，天津市津北精细化工有限公司；琼脂，脂海市长坡琼脂厂；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌均由上海复旦大学先进材料实验室提供；实验用水为蒸馏水2.1.2 实验仪器DDS-11A 型电导率仪，上海虹益仪器仪表有限公司；DJS-1C 型电导电极，上海精密科学仪器有限公司；800B 台式离心机，上海安亭科学仪器厂； KQ-500DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GSP-9050MBE 隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；WHF7200 型可见分光光度计，尤尼科（上海）仪器有限公司；NICOLET380傅里叶红外光谱仪，美国尼高力公司；LDZX-50KB 立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。

2.2实验内容 2.2.1壳聚糖—银配合物的制备在 0.100g 壳聚糖粉末中加入 25.00mL 的 AgNO3 溶液，然后放置超声波清洗仪中，在一定温度条件下超声振荡反应反应结束后，测定反应前后溶液中 Ag+的含量，计算壳聚糖对 Ag+的吸附量并将配合物进行洗涤抽滤，配合物用蒸馏水洗涤多次，直至无 Ag+检出；40℃干燥，即得到壳聚糖-银配合物以壳聚糖对 Ag+的吸附量为衡量指标，探讨了 AgNO3 浓度、反应时间、反应温度、pH 值对Ag+的吸附量的影响2.2.2电导滴定法测定溶液中银离子含量电导法是根据溶液的电导与被测离子浓度的关系来进行分析的方法在滴定终点前后溶液电导有显著转折的体系，可以进行电导滴定实验中的 Ag+与加入的 Cl¯的反应为沉淀反应，在达到反应终 3点时溶液中离子含量降到最低值，后来加入的 Cl¯又使溶液中离子含量上升，出现了显著的转折点，所以采用电导法来测定溶液中银离子含量将反应结束后的溶液放在离心机中离心，吸取上层清液用已知浓度的 NaCl 基准溶液在电导率仪上滴定上层清液，根据电导的确定上层清液的浓度，平行做三次，算得得到消耗的 Ag+吸附量壳聚糖对 Ag+的吸附量（Q t）按公式 1 计算：Qt=V(ρ0-ρt)/m （公式 1）Qt—壳聚糖的吸附量（mg/g）；ρ0—初始溶液中 Ag+的质量浓度（mg/mL）；ρt—反应后溶液中 Ag+的质量浓度（ mg/mL）；V—溶液的体积（mL）；m—壳聚糖的质量（g）。

2.2.3红外光谱分析 [12]采用 KBr 压片法，在傅里叶红外光谱仪上对 壳聚糖、壳聚糖- 银配合物的结构进行红外光谱表征，波数范围为 400 -4000cm-12.2.4培养基的制作大肠杆菌琼脂培养基：蛋白胨 10.0g/L，酵母浸膏 5.0g/L，氯化钠 10.0g/L，琼脂 20.0g/L；用80.0g /L 的氢氧化钠溶液调整 pH 值为 7.0；120℃，0.1MPa，20min 高压蒸汽灭菌大肠杆菌培养基：蛋白胨 10.0g/L，酵母浸膏 5.0g/L，氯化钠 10.0g/L；用 80.0g /L 的氢氧化钠溶液调整 pH 值为 7.0；120℃， 0.1MPa，20min 高压蒸汽灭菌白色念珠菌琼脂培养基：蛋白胨 10.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，琼脂 20.0g/L；用 80.0g /L 的氢氧化钠溶液调整 pH 值为 6.4；120℃ ，0.1MPa ，20min 高压蒸汽灭菌白色念珠菌培养基：蛋白胨 10.0g/L，葡萄糖 20.0g/L；用 80.0g /L 的氢氧化钠溶液调整 pH 值为6.4；120℃，0.1MPa，20min 高压蒸汽灭菌枯草芽孢杆菌琼脂培养基：蛋白胨 15.0g/L，酵母浸膏 0.5g/L，氯化钠 5.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，琼脂 20.0g/L；用 80.0g /L 的氢氧化钠溶液调整 pH 值为 7.0；120℃，0.1MPa，20min 高压蒸汽灭菌。

枯草芽孢杆菌培养基：蛋白胨 15.0g/L，酵母浸膏 0.5g/L，氯化钠 5.0g/L，葡萄糖 20.0g/L；用80.0g/L 的氢氧化钠溶液调整 pH 值为 7.0；120℃，0.1MPa，20min 高压蒸汽灭菌2.2.5抑菌圈的测定 [13]将滤纸片剪成小圆圈滤纸片（直径为 6.0mm） ，分别浸泡在不同浓度的材料溶液中， 15min 后取出，晾干，待用用浓度为 5×105cfu/mL～5×10 6cfu/mL 的三种菌分别取 200μL 于相应的培养基上，用涂布棒均匀地涂抹三次用镊子将圆形滤纸片平整地贴于培养基上，各样片中心之间相距 50mm 以上，与平板的周缘相距 15mm 以上将培养皿放置于 37℃ 培养箱中24h 之后观察、记录结果重复实验三次，用直尺测量抑菌圈直径，取平均值2.2.6 抑菌率-时间测定将各微生物菌种活化后，接种到肉汁蛋白胨固体培养基斜面上，置于37℃恒温培养箱中培养至细菌活化良好．在相对应的培养基中配制一定浓度的菌悬液，使其经血球计数板计数后菌悬液的浓度为1×106cfu/mL～ 1×107cfu/mL[14]用 1.00mL 菌悬液加入到装有 8.00mL 0.9%无菌生理盐水的试管中，用移液枪准确取经消毒的1.00mL 浓度为 2mg/mL 的壳聚糖 —银配合物溶液分别放入试管中；同样的方法以 0.9%的无菌生理盐水的试管作空白对照。

所有的试管放在恒温摇床上 37℃、转速 130r/min 下振荡不同时间后，从每管取出 100μL 菌悬液，对倍稀释，最后取 200μL（此时的稀释液将会在平板上生长 30 至 300 个菌落数）均匀地涂布于肉汁蛋白胨固体培养基上，放入恒温培养箱里 37℃下培养 24h，记录菌落数。