分子遗传学遗传重组.ppt

Chapter 5Genetic Recombination遗传重组Outline：：1.什么叫遗传重组？2.遗传重组的类型3.同源重组的分子机制4.细菌的转化、接合和转导5.同源重组的酶学机制6. 位点特异性重组位点特异性重组7. 转座8. 插入序列、复合转座子9. 转座的分子机制10.真核生物转座子Mutation 突变个体基因突变基因间交流适者生存广义：任何造成基因型变化的基因交流过程都叫遗传重组(genetic recombination)狭义：涉及DNA分子内断裂-复合的基因交流，有时又叫交换（crossingover）DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(geneticrecombination)重组产物为重组体DNA(recombinantDNA)Section 1 遗传重组概述Outline of genetic recombination? 用于染色体上的基因作图（重组频率与基因之间的距离相关）? 培育转基因细胞和生物重组原理的应用Genetic recombination? Homologous Recombination同源重组? Site-specific Recombination位点特异性重组? Transposition Recombination转座作用? Illegitimate Recombination异常重组------ 指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的 DNA分子之间或分子之内的重新组合。

通常根据Holliday 结构(hollidayjuncturestructure) 的形成和拆分分为 3个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holliday 结构的拆分Section 2 Homologous Recombination同源重组同源重组反应 严格依赖 DNA 分子之间的同源性100%同源------Homologous Recombination<100%同源------Hemologous Recombination原核生物：通常放生在DNA复制过程中真核生物：常见于细胞周期的S期之后Homologous recombination occursbetweenidenticalor nearly identicalsequences .It isalso called general recombination.同源重组需要满足的条件：（1）在交叉区域含有相同或几乎相同的碱基序列；（2）双链DNA分子之间发生互补配对；（3）需要重组酶的催化；（4）形成异源双链；（5）发生联会1. 切断(nicking)2. 链置换(strand displacement)3. 单链侵入(single-strandinvasion)4. 噜噗切除(loop cleavage)5. 链同化(strand assimilation)6. 异构化(isomerization)7. 分支迁移(branch migration)一、同源重组的分子机制（一）断裂-复合及Holliday 中间体重组的前提之一是参与重组的两条重组的前提之一是参与重组的两条 DNA分子必须分子必须靠近，同源序列之间严格配对，配对又叫做联会(synapsis) 。

DNA invading(recA)Branch migration(recA)DNAligase5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday intermediate5′3′5′3′5′3′5′3′endonuclease(recBCD)endonuclease(recBCD)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′Holliday intermediate5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′endonuclease(ruvC)endonuclease(ruvC)DNA ligaseDNA ligasepatch recombinantsplice recombinant电镜下的Holliday结构2012-3-1 ThursdayChengdu Medical College18以上讨论的是两个完整的双螺旋 DNA分子之间的重组。

重组也可以发生在一个完整双螺旋DNA分子和一个片段（单链的和双链的）之间二）细菌转化、接合和转导的重组机制Bacterial Conjugationhas been defined asthe transmissionof genetic informationfroma donor bacterium to a recipient cell throughcell-to-cell contact.（donor 供体；recipient 受体）§ 1 Conjugation 接合Conjugation processConjugation processConjugation processIntroductionof an exogenousDNA into acell,causingthecelltoacquirea newphenotype .（exogenous 外源的；phenotype 形态）§ 2 Transformation 转化DNATransformationTransformation experiment of Streptococcus pneumoniaeTransductionisthetransferofDNAfragmentsfromone bacteriumto anotherbacterium by a bacteriophage .（exogenous 外源的；phenotype 形态）§ 3 Transduction 转导Transduction1. E.coli 的RecA 蛋白是一个39kDa的单肽链，是同源重组过程中最重要的蛋白质，也叫重组酶(recombinase)2. 作用：促进同源DNA联会和促进DNA分子间的单链交换二、同源重组的酶学机制①① 单链单链DNA结合活性结合活性② 双链DNA结合活性③ NTP酶活性④ 促进互补单链复性的能力RecA 蛋白在同源重组的具体作用分为3个阶段个阶段：1.RecA的第一个DNA结合位点（初级位点）与单链DNA结合，包被DNA，形成蛋白质-DNA丝状复合物；2.RecA的第二个DNA结合位点（次级位点）与1个双链DNA分子结合，形成三链DNA中间体，随后单链DNA侵入双链DNA，寻找同源序列；3.RecA催化链交换，由被RecA包被的单链DNA从5′→3′方向取代双链DNA分子之中的同源旧链，形成异源双链，并发生分叉迁移RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换RecA蛋白促进单链DNA与双链DNA进行链交换RecA 蛋白单体的三维结构模型RecBCD 蛋白蛋白：1.由RecB、RecC 和RecD三个亚基组成。

2.具有5种酶的活性——外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶；；3.RecBCD 蛋白参与细胞内的RecBCD同源重组途径——首先它与双链DNA分子自由末端结合，依靠其外切核酸酶V的活性同时降解DNA的2条链，然而，一旦遇到 chi（χ）序列，RecD亚基就从复合物中释放出来，留下来的RecBC 蛋白开始以解链酶的活性发挥作用，在水解 ATP的同时，解开DNA双链，产生单链DNA，为RecA发挥作用铺平道路，最终起动了链交换和重组反应RecBCD 蛋白的作用模型RecF 途径途径：这主要是质粒之间进行重组的途径，需要的蛋白质有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等Site-specificrecombinationoccursat aspecific DNA sequence.位点特异性重组发生在两条DNA的特异位点上The first example was found in the integrationbetween l DNA and E. coli DNA.Section 3 Site-specific Recombination位点特异性重组λDNA integrationλ噬菌体的位点特噬菌体的位点特异性整合Transposition is the movement of specific pieces of DNA in the genome.转座过程中，转座成分从染色体的一个区段转移到另一个区段或从一条染色体转移到另一条染色体。

由于转座作用总是伴随着转座成分的复制，故又称为复制重组(replicative recombination)Section 4 Transposition转座作用转座作用Transposition resembles site-specific recombination being catalyzed by special enzymes.转座类似于位点特异性重组，只不过需要特殊酶的催化可转移成分现在一般叫做转座单元，简称转座元（transposons ），也叫做转座子虽然“转移”，但是“复制”------转座作用涉及转座子的复制（replicative recombination），当一个拷贝插入基因组的新位置后，原来位置上仍保留一个拷贝和同源重组及位点特异性重组不同，转座作用不依赖转座子和靶点之间以及供点和靶点之间任何的序列同源性§§1 1 细菌中的转座作用细菌中的转座作用转座子转座子插入复制使靶点处基因失活；存在及复制加重了细胞的生理负担基因缺失、倒位、易位；作为袖珍同源区域允许重组发生；某些细菌质粒进化的方式细菌中的转座成分依细菌中的转座成分依 组成结构组成结构可以分为：可以分为：插入序列(insertionseq uence s)、复合转座子(compositetransposons)、、TnA 转座子家族(TnAfamily)和可转移噬菌体 (transposablephages)1.插入序列(insertion sequences) ISinsertion sequences (IS) including:inverted terminal repeats (IR)：15~25bptransposase genedirect repeats ：5~9bpIS TranspositionTransposase genetypes of IS transposition? duplicative transposition? Conservative transpositionduplicative transpositionConservative transpositionIS的转座机制IS的结构的结构transposon? Insertion sequence + another gene (usually antibiotic gene)Transposase genetet-R geneTransposons Transposition2.2.复合转座子复合转座子(compositetransposons)复合转座子含有一个中心序列和位于其两侧的壁（IS或类IS）。

中心序列含有抗药性基因等遗传信息左、右两个壁在序列上相似，因此有时又叫长末端重复(l engt hyterminal repeat)3.3.TnA转座子家族转座子家族(TnA family)较长，约5000bp，比IS长的多同时携带有负责自身转座的基因和诸如抗药性基因等其他基因两端没有IS或类IS组件4.4.可转移噬菌体可转移噬菌体(Mu phages)以E.coli 为寄主的温和噬菌体，以裂解生长和溶源生长两种交替方式之一繁衍自己复合型转座子的结构Mu噬菌体的结构真核生物的转座子真核生物的转座子? 根据转座的机理将真核生物的转座子分为二类：第一类是反转座子，其转座过程是DNA→RNA→DNA，需要RNA中间体；第二类是DNA转座子，其转座过程是DNA→DNA，无RNA中间体 DNA转座子又分为复制型DNA转座子和保留型DNA转座子，其中，复制型在转位前后，原位置上的拷贝仍然存在，只是通过“复制”和“粘贴”的方式，复制一份到新的位点；而保留型在转座中，原来的拷贝被“剪切”后“粘贴”到新的位点，即原来的拷贝被原封不动地转移并保留到新的位点 每一类转座子都有自主型和非自主型自主型转座子的内部含有开放的阅读框架，自己编码转座所必需的酶或蛋白质；非自主型转座子缺乏足够的编码能力，却保留了转座所必需的顺式元件，在合适的自主型转座子编码的转座酶的作用下，它们照样可以进行转座。

玉米的Ac-Ds系统? McClintock在玉米基因组发现的 Ac-Dc系统可谓是最有代表性的例子Ac代表激活元件，属于自主型，带有全功能的转座酶基因；Ds代表解离元件，属于非自主型，带有缺失的转座酶基因，由Ac突变而来Ac和Ds之间关系密切，一“主”一“仆”，Ds单独不能移位，因为它不能合成转座酶同一个细胞内，必须有Ac的存在，Ds才会移动 如果Ac或Ds插入到玉米种子的紫色色素基因 C内部，则紫色色素基因被关闭，使玉米籽粒不能产生紫色色素，而成为黄色；如果Ds从C内跳开，C所受的抑制作用即被解除，玉米籽粒又变成紫色；如果 Ds跳到远离Ac处，或者Ac本身跳开，Ds即不受Ac的控制，它又可以发挥对结构基因 SG的抑制作用，使玉米籽粒成为黄色 Ac和Ds跳动得如此之快，使得受它们控制的颜色基因时关时开，于是玉米籽粒便出现了斑斑点点反转座子反转座子? 反转座子在真核生物的基因组中占很高的比例，它在结构、性质和转位的方式上与逆转录病毒的复制很相似首先是 DNA被转录为RNA中间物，然后RNA中间物被逆转录成双链 DNA，最后，双链DNA在新的位点上整合到基因组 DNA上 根据两端的结构，反转座子可进一步分为 LTR反转座子和非LTR反转座子：前者的两端是直接的长末端重复序列；后者无LTR序列，但有一端终止于 1小段重复序列（通常是 poly A）。

无论是哪一类，仍然有自主型和非自主型之分如果是自主型的，其内部含有gag基因和pol基因，但缺乏编码外壳蛋白的 env基因pol基因能够编码蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶 H和整合酶；如果是非自主型的，则内部序列大小变化很大，缺乏大多数或者全部编码功能反转座子在某种意义可视为有缺陷的逆转录病毒转座的分子机制转座的分子机制? “剪切”和“粘贴”机制? “复制”和“粘贴”机制转座酶转座酶（1）DDE-转座酶，这一类转座酶含有高度保守的三联体氨基酸残基，即Asp、Asp和Glu，这三个氨基酸残基是参与催化的2价金属离子（主要是Mg2+）与酶分子的配位结合所必需的；（2）Y2-转座酶，活性中心有2个Tyr残基参与催化；（3）Y-转座酶，活性中心1个Tyr残基参与催化；（4）S-转座酶，活性中心的Ser 残基参与催化；（5）RT/En-转座酶，有逆转录酶和内切酶组合而成由DDE转座酶介导的转座子“剪切”和“粘贴”机制由Y-转座酶或S-转座酶介导的转座子“剪切”和“粘贴”机制转座子的转座子的““复制复制””和和““粘贴粘贴””机制机制反转座子的转座机制反转座子的转座机制。