氨基酸含量测定.docx

茚三酮比色测定氨基酸含量一、 实验原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸 外均有此反应），可用吸光光度法测定生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与 氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定 样品中氨基酸含量二、 实验试剂（1） 1.2%茚三酮溶液:称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解， 加入40mg氯化亚锡（SnCl2・ H2O），搅拌过滤（作防腐剂）滤液置冷暗处过 夜，加水至50mL，摇匀备用2） pH 8.04磷酸缓冲液：I、 准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解 后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用II、 准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶 解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用III、 取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均 匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液3） 氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧 杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀， 准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200曜/mL 氨基酸标准溶液。

三、 实验方法及步骤（1）标准曲线绘制准确吸取 200pg/mL 的氨基酸标准溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600瞄 氨基酸），分别置于25mL容 量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L） 和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL,混合均匀，于90°C水浴上加热至显色 恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线， 摇匀静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A；若生成的化合物呈黄色，则在350nm波长 下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A以氨基酸的微克数为横坐 标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线A值度光'oloo-oo O o o o o o OO10.le o Oy = 0.000935x + 0.002679100 200 300 400 500 600 700氨基酸含量/.g图1 350nm波长下氨基酸与吸光度线性关系图（雷恩，2016）（2） 提取样品称取1.0-2.0g植物样品（新鲜样或干样），加5mL 10%醋酸，在研钵中研碎， 用水洗移入100mL容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。

该样品提 取液可继续用来测定可溶性蛋白质含量（考马斯亮蓝G-250法）（3） 样品测定吸取澄清的样品溶液4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光 度A值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数4） 结果计算氨基酸含量（.g /100g）= Lttt •二二EEH^a.^ U U IJ式中：c一从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，.g；m—测定的样品溶液相当于样品的质量，g四、说明及注意事项（1）茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色， 使用前须进行纯化，方法如下：取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性 炭，摇动1分钟，静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结 晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用2) 应控制反应溶液的pH才能得到重现性好的结果，反应液pH在6.2 - 6.4 之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2:1或1:13) 要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全沸水 浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度(80°C)，延长 加热时间，使发色均匀也可以在烘箱中加热，105C烘10分钟。

4) 茚三酮与氨基酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快， 应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色5) 明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸(酪氨酸等)也 被活性炭吸附，会使结果降低6) 茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物 质会干扰测定7) 植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时 应说明样品处理。