免疫组化的基本步骤.docx

免疫组化步骤1. 4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4°C ）中过夜蜡块制作切片， 贴片0.01MKPBS 清洗 5minX3 后；2. 加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml + 30%过氧化氢） 30min,以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5minX3；3. 加入配好的 0.3% Triton X100 （30% Triton X100+0.01MKPBS 100ml） 30min，以增加细胞 的通透性，0.01MKPBS清洗5minX3；4. 加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml +叠氮纳0.08g）稀释的一抗， 4C存放 24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS 洗 5minX3；5. 加入0.01MKPBS稀释的二抗，室温孵育2ho 0.01MKPBS洗5minX3；6. 加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5minX3；蒸馏水迅速冲三 次；7. 加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行 观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入 0.01MKPBS终止反应；8. 梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

免疫组化主要步骤1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等 除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整 ,便于组织吸附,然后置于清水中 清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之 中，然后放到架子上，置于37° C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带 正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于 石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使 石蜡变成固态3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左 右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难 切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40C温水中4. 捞组织：当组织载玻片置于 40° C 温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡 受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一 般取载玻片的下1/3或者下 1/2 一般每种组织捞5-6张，其中 2-3张是备用的，每张载 玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时 候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入 37。

C 温箱中烘 干5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒 精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中 放10min,天气热可以少放几分钟，相反,天气较冷的话，就要适当延长脱蜡时间，一般为 12-15min.6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性 的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2,在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉 中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温， 蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来7. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中 5min,洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭 起来，然后放入37° C温箱中半小时血清稀释10倍（900µIPBS： 100µl 血清封闭液）8. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加 一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。

加完一抗后于4° C冰箱中保存过 夜9. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS 后加上二抗,然后置于 37° C 温箱中半小时10. 加SABC:将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后 加上SABC,然后置于37° C温箱中半小时SABC稀释100倍（990µIPBS： 10µlSABC）11. 加显色剂：将片子从温箱中取出 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀，然后加1滴显色 剂B,摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀） A： DAB B： H2O2 C：磷酸缓冲液12. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为 半分钟，植物组织 3-5min13. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70%酒精-80%酒精-90%酒 精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯每个试剂中放置2min,最后浸泡在 二甲苯中，搬到通风柜中14. 封片：用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一 侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。

免疫组化操作步骤一. 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ：1． 切片常规脱蜡至水如需抗原修复,可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟4. 缓冲液洗 5min/2 次5. 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色注：孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清,这一步可以省略6. 缓冲液洗 5min/2 次7. 滴加一抗工作液37 °C孵育1 — 2小时具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增强子 ） , 在室温下孵育 20 分钟10 ．缓冲液洗 5min/2 次11 ．滴加 HRP Polymer（ 酶标二抗 ） ,在室温下孵育 30 分钟注： HRP Polymer 对光敏感,应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen（或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上,孵育 3 — 15 分钟具体时间由染 色深浅决定14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片二．免疫组化 （ 三步法 ） 操作步骤 ：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行） 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗 滴加一抗工作液，37 °C孵育1-2小时或4 °C过夜 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 C 孵育 10-30 分钟 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 C 孵育 10-30 分钟。

9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4-8um，室温放置30分钟后，入4 C丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟x3, 用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性以下同石蜡切片免疫组化。