拟南芥的种植.docx

一、 拟南芥播种种子装入dorf管内，20以种子加1ml 75%乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤 15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每 次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4°C冰箱内冷处理2-3天（春 化）MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml二、 MS固体培养基制备1. 培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称 量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩 液叫做培养基母液这样每次使用时，取其总量的1/20（50 mL）或 1/200（5 mL），加水稀释， 制成培养液现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用大量元素（母液I，20x) mg /LCoCl2-6H2O 5NH4NO333 000铁盐（母液m，200x） mg/Lkno338 000FeSO4・7H2O 5 560CaCl2-2H2O8 800Na2-EDTA・2H2O 7 460MgSO4-7H2O7 400KH2PO43 400有机成分（母液W，200x） mg/L微量元素（母液II，200x） mg/LKI166肌醇 20 000H3BO31 240WBMnSO4・4H2O4 460烟酸 100ZnSO4・7H2O1 720盐酸毗哆醇（维生素B6） 100Na2MoO4・2H2O50盐酸硫胺素（维生素B1） 100CuSO4・5H2O5甘氨酸 400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

其中，母液I、母液II及母液W的配制方法 是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶， 最后定容到1 L母液III的配制方法是：将称好的FeSO4-7H2O和Na2-EDTA-2H2O分别放到450 mL蒸馏 水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5,最后定容 到1L，保存在棕色玻璃瓶中2. 配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液I为50 mL，母液II、m、RA 和WB各5 mL3. 溶化琼脂4. 调 pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边 搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4〜7.0）测培养基的pH, 一直到培养基的pH为5.8为止（培 养基的pH必须严格控制在5.8,因高温灭菌时pH会下降，所以灭菌前通常pH配成6.2左 右）5. 培养基的分装6 .高压灭菌三、拟南芥的种植1. 人工土配制18份蛭石，6份黑土和1份珍珠岩混合均匀，分装于塑料灭菌袋内，扎好口，于98 kPa、 121.3 °下，灭菌40 min冷却后备用有时也用两种土，即上层用不含黑土的人工土，下层用上面所讲的土。

我估计原因可能 有二：一是黑土容易生霉；二是黑土较难完全粉碎，较大的块状土不便于移栽2. PNS营养液：每升含5ml 1M KNO3,2ml 1M Ca(NO3)24H2O,2ml 1M MgSO4.7H2O,2.5ml 20mM Fe.EDTA,2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml微量元素注意：营养液用煮沸冷却后的凉开水配置磷酸氢二钾9.12gPNS营养液母液配方：① 1M KNO3 101.1g⑥微量元素② 1M Ca(NO3)2.4H2O 236.15 g硼酸0.434g③ 1M MgSO4.7H2O，246.48 g硫酸锰（MnSO4H2O) 1.7626g④ 20mM Fe.EDTA：CuSO4.H2O0.0798gFeSO4 5.57gZnSO4.7H2O0.172gEDTA 7.45gNaMoO4.2H2O0.0432g注意先各自配成溶液，再混合NaCl0.585g⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：CoCl.6H2O0.00129g磷酸二氢钾 130.4g以上母液均配至1L种子春化A. 取适量种子置于标记好的1.5ml离心管中，加入1 ml 70%乙醇轻微振荡1 minB. 去乙醇，加入1 ml体积分数为10%的NaClO （次氯酸钠），消毒5~10 min；C. 吸去NaClO,用无菌水冲洗种子5次后，加入600/无菌水；D. 用1ml移液枪将水连同种子吸起，均匀铺于MS平板，每皿60~100粒种子;E. 吸去并风干培养基表面多余的水分。

F. 加盖，封口，4°C冰箱放置2〜3d，春化使种子萌发同步化土壤培养从春化算起，平板上培养7~14 d，当幼苗具4片真叶时转入土壤（1株/盘）进行土培加盖保 鲜膜1 d，及时浇水培养条件温度：20C〜22C；湿度：70%左右；光照强度：100〜120 gmol-m-2-sec-1；在长日照条件下（16h光照，8h黑暗）培养不同光质处理时，各种光质相应光强分别为，蓝光（BL）：20 gmol.m-2.s-1 ；红光（Rc）： 20 gmol.m-2.s-1 ；远红外光（FRc）： 1.8 gmol.m-2.s-1，其余条件 同前。