实验五 果蔬中过氧化物酶活力测定.docx

实验五 果蔬中过氧化物酶活力测定一、目的要求 了解过氧化物酶的生物氧化作用，学习过氧化物酶的测定方法二、实验原理 过氧化物酶属氧化还原酶，能催化底物过氧化氢对某些物质的氧化反应中的供氢体可为各种多元酚（愈创木酚、间苯二酚）或芳香族胺（苯胺、联苯胺、邻苯二胺）以及 NADH2、 NADFH2本实验以愈创木酚为供氢体，出2为氢的受体，愈创木酚在过氧化物酶催化作用下被氧化后，生成褐色的有色产物，根据酶活力大小与有色产物颜色的深浅成正比，在波长下测定其吸光值，可求出过氧化物酶的活力 4H2O2过氧化物酶四邻甲氧基联酚8H2O愈创木酚以每分钟吸光度的变化值表示过氧化物酶活力大小，即以 A470/min.g 鲜重计算测定过氧化物的实际意义在于，过氧化物广泛存在于植物组织中，在果蔬加工过程中的 主要作用包括两个方面：（1）过氧化物酶氧化作用与果蔬原料，特别是非酸性蔬菜在保藏期 产生不良风味有关；（2）过氧化物酶属最耐热的酶类，在果蔬加工中果蔬中过氧化物酶活力 大小常被用作衡量果蔬热处理灭酶是否充分的指标，因为当果蔬中的过氧化物酶在热烫中失 活时，表明其它酶以活性形式存在的可能性以达到最小三、试剂及材料1、 30%过氧化氢。

2、 愈创木酚3、 20 mmol/L 磷酸二氢钾溶液：称取 2.72g 磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解并定容至 1000mL4、 100 mmol/L磷酸PH6.0缓冲溶液：吸取6.3 mL磷酸加水至100 mL,用氢氧化钠调 整至所需的PH5、 反应混合液：取25 mL磷酸缓冲溶液于烧杯中，加入愈创木酚140 ul,于磁力搅拌 器中搅拌至愈创木酚溶解，加入30%过氧化氢95 ul,混匀置冰箱保存备用6、 新鲜白菜梗四、 仪器设备 可见光分光光度计五、 操作方法1、 酶液提取：取白菜梗10g,加入磷酸盐溶液30mL，置于研钵中充分研磨，用磷酸盐 溶液定容至100 mL,过滤备用2、 取两根试管，其中一根试管加入反应混合液3.0 mL,磷酸盐溶液1.0 mL,作为光度 计调零对照；另一试管加入反应混合液3.0 mL，酶液0.1 mL，补充磷酸盐溶液至总体积为 4.0 mL,迅速混匀1分钟后使用1cm玻璃比色皿，在470波长条件下测定其吸光值，连续 测定5次，间隔时间均为1分钟记录测试结果重复3次，取R2值最大的一组数据测试时间(min)012345A470nm03、 求吸光值y = aa470 t + b回归方程。

4、 温度对过氧化物酶活力的影响实验 分别取10g白菜梗置于70°C、90°C温度条件下 热烫处理3min,再按1操作方法置备酶液按上述方法测定各吸光值，比较热处理前后 酶活力大小只做一次即可六、 结果计算与讨论过氧化物酶活力=AA470 x 100 / (m x V1)式中V1—测定时吸取供试酶液的体积(mL)m—提酶样品重量(g)100—酶液稀释总体积(mL)七、 思考题1、 过氧化物酶的作用机制是什么？测定其酶活力对食品果蔬加工有何实际意义？2、 实验操作要点是什么？。