卵母细胞、GDF9及TGFβ1在大鼠PCOS中的局部作用.pdf

暨南大学博士学位论文卵母细胞、G D F 一9 及T G F —B l 在大鼠P C o S 中的局部作用T h eL o c a lR o l eo fO o c y t e ，G D F - 9a n dT G F —B li nt h eP C O SR a t作者姓名：苗竹林指导教师姓名：王自能及学位、职称：博士、教授学科、专业名称：医学、妇产科专业论文提交日期：二0 0 五年四月论文答辩日期：二0 0 五年五月答辩委员会主席：申洪教授论文评阅人：申洪教授，朴英杰教授，钟雪云教授学位授予单位和日期：暨南大学二0 0 五年六月弋经作者、导师蔚慧 勿全文公布．’卵母细胞、G D F ．9 f l t T G F B l 在大鼠P C o S 中的局部作用暨南大学附属第一医院妇产科学教研室博士研究生苗竹林导师王自能教授中文摘要目的：以脱氢表雄酮诱导的多囊卵巢综合症( p o l y c y s t i co v a r ys y n d r o m e P C O S ) 大鼠为研究对象，探讨卵母细胞、G D F ．9 及T G F —t 3 1 在P C O S 大鼠卵巢卵泡囊状变性、间质纤维化、包膜增厚、优势卵泡形成障碍以及激素水平变化等方面的作用机制。

方法：1 ．利用脱氢表雄酮( d e h y d r o e p ia n d r o s t e r o n e ，D H E A ) 皮下注射的方法复带I J P C O S 病理模型并采用下列方法来验证模型：微粒子酶免分析法测定血清激素水平，包括血清雌二醇( E 2 ) ，睾酮( T ) 、黄体生成素( L H ) 、卵泡刺激素( F S H ) 、L H ／F S H 、空腹胰岛素( F r N S ) 值；H E 染色方法观察P C O S 大鼠卵巢的病理结构；透射电镜技术观察P C O S 大鼠卵巢超微结构的变化2 ．采用透射电镜技术观察P C O S 组( 肝8 ) 与对照组( M = 8 ) 卵泡卵母细胞的超微结构变化3 ．采用免疫组织化学方法检测P C O S 组( n _ 2 0 ) 与对照组( 胪2 0 ) ，大鼠卵巢生长因子G D F 一9 、T G F —B 】的表达，并进行图像分析4 ．采用半定量逆转录聚合酶链反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ．R T - P C R ) 法检测P C O S 组( 舻8 ) 与对照组( 萨8 ) 生长因子G D F ．9 受体B M P R ．J I ，以及T G F 一1 3 1 受体T 8 RI 、T [ 3 R I I m R N A 的转录，通过凝胶图像分析系统对P C R 产物进行半定量分析。

5 ．采用免疫组织化学方法检测P C O S 组( ”= 2 0 ) 与对照组( 月= 2 0 ) 信号蛋白S m a d 4 2的表达；应用半定量R T - P C R 法检测P C O S 组( “ = 8 ) 与对照组( “ = 8 ) S m a d 4 和S m a d 7基因的转录，通过凝胶图像分析系统对P C R 产物进行半定量分析结果：1 ．P C O S 组血清T 值、E 2 值、空腹胰岛素水平显著高于对照组( P O ．0 5 ) ：而T G F ．B l 在P C O S 窦状卵泡膜细胞及间质中的表达强度显著增高( P O ．0 5 ) ，b u tt h ee x p r e s s i o ni n t e n s i t yo fT G F - B li nt h et h e c ac e l l so fa n t r a lf o l l i c l e sa n dt h es t r o m a lc e l l so fP C Og r o u p sw e r em a r k e d l yh i g h e rt h a nt h o s eo f t h ec o n t r o lg r o u p sr e s p e c t i v e l y ，，P 2 7 5 卜m ，再根据直径大小分为5 级( 1 级：2 7 5 1 x m ．3 5 0 1 a m ：2 级：3 5 0 1 x m 一4 0 0 1 z m ；3 级：4 0 0 1 a m - 4 5 0 斗m ；4 级：4 5 0 1 a m ‘5 7 5 1 x m ：5级：> 5 7 5 斗m ) 。

小窦状卵泡：l ～3 级大窦状卵泡：3 级以上3 ．7 光镜下判断闭锁卵泡标准：卵泡形态不规则，卵母细胞内出现核严重偏位、固缩．透明带塌陷；颗粒细胞及卵泡膜细胞松散、萎缩并脱落进入卵泡腔内为闭锁卵泡f ⋯3 ．8 统计学分析：应用S P S S l 0 ．0 统计软件作统计分析计量资料结果以均数4 - 标准差表示，两个样本均数的比较采用t 检验采用卡方检验( P e a r s o n 卡方检验不校正，和F i s h e r 精确检验) ，对两样本卵母细胞异常发生率进行比较P 0 ．0 5 ) 见表1表1 - 1 两组血清激素水平比较伽= 2 0 )1 ’口b l —lC o m p a r i s o no f s e r u mh o r m o n ev a l u ei nt w og r o u p s+ P D0 5 ) ，见表1 —3 表1 ．3 两组卵巢中窦状卵泡卵母细胞情况比较T a b l - 3C o m p a r i s o no f o o c y t e so f a n t r a l f o l l i c l e si nt w og r o u p s 一±一，> n 0 5V SC o n t r o lG r o u p4 ．4 ．2 正常大鼠窦状卵泡卵母细胞的超微结构卵母细胞体积逐渐达到最大，细胞核形状规则。

胞浆内线粒体、核蛋白体等细胞器丰富：并可见高尔基复合体、内质网；成群的胞浆板层样结构均匀的分布于胞浆中，有的呈同心圆状；卵母细胞表面微绒毛( M i c r o v i l l i ，M V ) 由垂直细长变粗，并逐渐退出透明带；卵丘颗粒细胞仍有少量突起伸入到透明带，见图l 一3 0 ，1 ．3 1 4 ．4 ．3P C O 大鼠窦状卵泡卵母细胞超微结构变化部分卵母细胞的胞质不均匀，成团块状；胞质中致密的退化线粒体及溶酶体聚集成团，内质网、高尔基体、核蛋白体等细胞器数量减少局部胞浆板层样结构消失，墼蜜叁茎垫堡堡堡圭耋堡垒塞：：：；：：：；；；篁三! §l 立微绒毛退化；卵母细胞透明带变形，呈不均质状：细胞质膜不完整，卵母细胞与透明带间出现腔隙；卵母细胞自身出现大的裂隙，将卵母细胞分为几个互相连接的部分周围卵丘颗粒细胞出现凋亡或衰退现象，见图l 一3 2 ，1 —3 3 ，1 —3 4 4 ．4 ．4 两组卵巢中窦状卵泡卵母细胞异常发生率比较本实验共观察到窦状卵泡卵母细胞4 6 个，其中P C O 组2 4 个，对照组2 2 个在观察的2 4 个P C O S 组窦状卵泡卵母细胞中1 6 个发生异常；而在对照组2 2 个中有5 个异常，P C O S组窦状卵泡卵母细胞异常发生率显著升高( P r O ．0 1 ) ，见表卜4表1 4 两组卵巢中窦状卵泡卵母细胞异常发生率比较T a b l - 4C o m p a r i s o no f a b n o r m a lo o c y t e sr a t eo f a n t r a l f o i l i d e si nt w og r o u p sG r o u pa n t r a l f o l l i c l e s 阳a b n o r m a lo o c y t e s 倒r a t e ( ％)P e a r s o n l e s t ，，= 8 ．9 3 1 8 ，尸= o ．0 0 2 8 ，P O ．0 5 ) 。

在P C O S 闭锁卵泡卵母细胞中未见G D F ．9 表达，囊状卵泡中卵母细胞多数脱落、缺失，亦未见G D F ．9因子表达表2 - 1 ，图2 ．1 ～2 ．6 表2 - 1G D F - 9 在两组卵泡卵母细胞中的表达强度比较( P 嘴，i 埘T a b 2 - 1C o m p a r i s o no f e x p r e s s i o ni n t e n s i t yo f G D F - 9i no o c y t e so f t w og r o u p sP > O ．0 5v sC o n } r o lg r o u p2 ．T G F - 1 3 l 在P C O S 卵巢中的表达：免疫组化结果显示：对照组大鼠卵巢组织结构规整，卵巢中可见不同发育阶段的卵泡和黄体，有少量闭锁卵泡，无囊性扩张的卵泡T G F —B 1 强表达于原始和窦前卵泡卵母细胞胞浆，而在颗粒细胞、卵泡膜及间质细胞表达较弱T G F ．B l 在各阶段卵泡卵母细胞的表达强度显著高于在颗粒细胞、卵泡膜细胞的表达，经统计学分析，差异有统计学意义( P O ．0 5 ) ，表2 ．3 与对照组比较：T G F ．B 】在P C O S 各阶段卵泡卵母细胞、颗粒细胞的表达强度差异无统计学意义( P > O ．0 5 ) 。

而在P C O S 窦状卵泡膜细胞的表达显著高于对照组妒 0 ．0 5 )4 3小窦前卵泡太赛前卵泡窦状卵泡图2 —2 0T G F - p l 在P C O S 组与对照组颗粒细胞表达强度变化图两组比较差异无统计学意义( P > O ．0 5 )引至4 ：昌2 l广-I10小窦前卵泡大窦前卵泡窦状卵泡图2 - 2 1T G F - [ 1 l 在P c 0 S 组与对照组卵泡膜细胞中表达强度直方图T G F 一0 l 在P C O S 窦状卵泡膜细胞的表达较对照组显著增强 | p = 0 ．0 0 t 5 { } P ●●JCCC∞驼∞如如如( 尸' O ．0 5 ) 而在P C O S 组卵泡膜及间质细胞中的表达显著增强，差异有统计学意义( P O ．0 51 0ii悄 寸 暑暑小窦前卵泡大窦前卵泡小窦状卵泡大窦状卵泡图4 - 1 4S m a d 4 在P C O S 与对照组卵泡膜细胞表达强度比较两组比较差异有统计学意义( + P < O ．0 5 ，} + ，< 0O l 、0 987654 32l02 ．S m a d 4 m R N A 、S m a d 7 m R N A 在P C O S 卵巢的表达：2 ．1S m a d 4 m R N A 的表达：实验组及对照组均于4 3 3 b p 和2 2 7 b p 片段大小的位置，见到两条清晰的条带。

两组4 3 3 b p 位置的条带明亮度与宽度接近；而实验组2 2 7 b p 大小条带( 预计由S m a d 4 引物扩增的产物) 的亮度与宽度明显增强凝胶图像分析结果显示其相对含量显著高于对照组( P < o ．0 5 ) ，见图4 一1 5 ，表4 - 4 2 ．2 ．S m a d 7 m R N A 的表达：实验组及对照组均于4 3 3 b p 和7 4 8 b p 片段大小的位置，见到两条清晰的条带两组4 3 3 b p 位置的条带表达强度接近；而实验组7 4 8 b p 大小条带( 预计由S m a d 7 引物扩增产物) 的亮度与宽度明显增强凝胶图像分析结果显示其相对含量显著高于对照组( 尸< O ．0 5 ) ，见图4 —1 6 ，表4 —4 图4 —1 5S m a d 4 m R N A 在P C O S与对照组卵巢中的转录M ：D N Af i - - l a r k e rL a n e1 ：C o n t r o lG。