毕业论文64683.doc

目 录摘要Abstract引言1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要的生化试剂1.1.2 供试农杆菌菌株和质粒1.1.3 转化实验所用植物细胞培养基配方1.2 根癌农杆菌介导的苹果遗传转化1.2. 1 苹果外植体材料的准备1.2. 2 农杆菌侵染液的制备1.2. 3 侵染1.2. 4 转化子的筛选再生2 结果和分析2．1 M7 无菌苗的扩繁2．2 M7 砧木的叶片再生2.3 农杆菌划线接种与单克隆繁殖2.4 叶片的转化再生3 讨论3.1 M7 再生的影响因素3.2 共培养条件对转基因的影响致谢参考文献苹果叶片转基因体系探索园艺专业 胡翔宇指导老师 段艳欣摘要：近年来，苹果遗传转化研究取得了较大的进展，已有多种标记基因和目的基因成功转入苹果中并且得到稳定表达和遗传农杆菌介导法是苹果上应用的主要转化方法，叶片再生不定芽途径是被广泛应用的受体系统影响农杆菌介导成功与否的因素很多，文章从转化方法、叶片再生能力、菌株类型以及农杆菌侵染条件等方面综述了目前有关研究成果，指出目前依然存在转化效率不高、外源基因表达强度不够、对转化植株的选择不够重视等诸多问题关键词：苹果；遗传转化；农杆菌介导；叶片再生Apples leaves gm systemStudent majoring in Horticulture Hu XiangyuTutor Duan YanxinAbstract: in recent years, apple genetic research has made great progress, various marker genes and gene into apple and successful expression and genetic stability. Agrobacterium-mediated technique was applied into the main apple, leaf regeneration in vitro shoot is widely applied receptor system. Affect the success of agrobacterium mediated many factors, this article from the transformation method, leaf regeneration, strains of bacteria infection type and reviewed the current conditions of relevant research results are pointed out, still exists transformation efficiency is not high, the exogenous gene expression of strength, selection of plant many problems, such as insufficient attention.Keywords: apple, Genetic transformation, Agrobacterium mediated, Leaf regeneration引言随着转基因技术的发展，用于苹果遗传转化研究的受体基因型越来越多，除了绿袖，主要还有红元帅（RedDelicious） [4]、新乔纳金 [5]、嘎拉（Gala ）、金（GoldenDelicious）、 Elstar [6]、Braeburn [7]、Merlijin [8]、乔纳金（Jonagold）、富士（Fuji）王林（ Orion） [9]、金矮生（Jonagored） [10]、皇家嘎拉（Royal Gala）、辽伏（Liaofu） [11]、元帅（Delicious ）、粉红佳人（Pinklady）、M7和八楞海棠 [12]等。

苹果愈伤组织再生植株尚存在较大困难，叶片再生胚状体还不够成熟且周期较长而大部分品种类型的叶片再生不定芽体系已经比较成熟， 且再生周期短，因而成为苹果转基因的主要受体系统叶片高效再生不定芽是实现基因转化的前提，是获得转基因植株的关键影响叶片高效再生因素包括试材的基因型 [17]，基本培养基类型，培养基中植物生长调节物质的种类及配比，光照条件和接种前叶片的生理生化状态（包括苗龄 [18]、叶片成熟度、叶片不同部位以及外植体的来源等），其中试材基因型是最重要的因子由于不同的菌株生长势不同，所以菌液浓度和侵染时间不同农杆菌菌液浓度太低，侵菌时间太短，叶片不能附着足够的菌液，转化率低；而过度的侵染不仅需要高浓度的抗生素来杀菌，材料所受的伤害也会太重，不利于转化材料的恢复，甚至导致材料软腐死亡应掌握的原则是繁殖速度快的菌株时间宜短，繁殖速度较慢的可适当延长对农杆菌敏感的植株，因其易产生过敏反应而导致外植体切口处褐化，可采用较低的OD值和较短的浸泡时间一般菌液浓度范围是OD600＝0.5～0.7，侵染时间不超过30 min农杆菌的附着，T－DNA的转移以及整合都在共培养期间完成，因此共培养技术条件的掌握是转化的关键。

农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T－DNA转移到植物细胞农杆菌附着后不能立即转化， 只有在创伤部位生存16 h之后的菌株才能诱发肿瘤因此，共培养时间必须长于16 h但共培养时间太长，农杆菌过度繁殖，将导致受体植株缺氧软腐死亡所以，共培养时间的确定以不对叶片造成伤害又最大限度提高转化效率为标准另外，共培养时培养基中高浓度的细胞分裂素比生长素更有利于转化 [21]酚类物质可以诱导vir基因的表达从而促进T－DNA的转移植物酚类化合物乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）、渗透保护剂磷酸甜菜碱（Betainephosphate，BP）能提高农杆菌的毒力当再生培养基中附加AS（0．1 mol/L ）时，绿袖的转化效率大大提高然而有时AS并不表现明显效果，张志宏等 [22]在研究中发现用AS（100μmol/L）处理菌株EHA105的细胞，未能提高转化效率AS可能是激活农杆菌的毒区，从而提高其侵染能力，而碳源的种类则对侵染与再生均有影响目前，苹果转基因研究进入瓶颈阶段第一，转化方法单一，主要使用农杆菌介导法第二，农杆菌介导的转化效率很低，Puite等用农杆菌介导的嘎拉、金帅、Elstar 的转化效率分别为0.7% ～8.0%，0.2%～6.0%，0.4%～0.8% [6]；张志宏等 [5]转化新乔纳金时，抗性芽诱导率仅为0.62%（9/1443 ），而其中只有4个转化植株明显表达GUS活性，抗性愈伤组织的诱导率虽然较（ 36.0%±5.4%），但未能从抗性愈伤组织分化出芽。

所以，探索适用于苹果遗传转化的新方法和提高农杆菌介导法转化效率，成为苹果育种工作者亟待解决的问题1 材料和方法 1.1 实验材料：苹果 M7 组培苗1.1.1 主要的生化试剂:头孢霉素（Cefotaxime, cef）购自北京鼎国生物公司，卡那霉素（Kanamycin, Km）购自美国 Sigma 公司，氯霉素（ chloromycetin，cm ）购自上海生工1.1.2 供试农杆菌菌株和质粒本研究使用的菌株为卸甲的农杆菌 EHA105质粒载体有 pROKII（西班牙Pena 博士惠赠） ，LEAFY (LFY)和 GUS 基因分别位于 CaMV35s 启动子下，NPTII 基因位于 NOS 启动子下，质粒图如下：图 1 质粒 pROKII 构建图Figure 1. The construction of plasmid pROKII-LFY1.1.3 转化实验所用植物细胞培养基配方各种培养基 pH 均为 5.8~6.0培养温度为 26±2℃ ，光照强度为 1500~2000 Lx，每日光照 14 h1.2 根癌农杆菌介导的苹果遗传转化 1.2. 1 苹果外植体材料的准备1.2.2 农杆菌侵染液的制备1)菌株活化：农杆菌在含有 km 30 mg/L 和 cm 50mg/L 的 LB 选择培养基上划线培养，28℃暗培养 2d。

2)单菌落繁殖：挑取单菌落接种在新的选择培养基上 28℃暗培养 2d3)侵染液制备：取出培养好的农杆菌，接种在不加 km 的 MS 悬浮培养基里，于 28℃180 r/min 振荡培养 1.5－2 h1.2. 3 侵染将外植体浸泡在制备好的农杆菌菌液里，静置 5 min 侵染，侵染完毕，用无菌滤纸吸干外植体表面菌液，于共培养基上 23℃暗培养 3 天1.2.14 转化子的筛选再生筛选培养基为 ，芽再生培养基2 结果与分析2.1 M7 无菌苗的扩繁（提供丛芽图片 1-2 张）2.2 M7 砧木的叶片再生（提供叶片长芽图片 1-2 张）2.3 农杆菌划线接种与单克隆繁殖（分别提供菌长出的图片）2.4 叶片的转化再生（提供共培养的叶片 图片 1 张，筛选再生的图片1 张）3 讨论3.1 M7 再生的影响因素3.2 共培养条件对转基因的影响（主要是温度和滤纸的有无）致谢本论文是在段艳欣老师的指导和贾东杰学姐的帮助下完成的从课题的选择到论文的最终完成，段老师始终都给予了细心的指导和不懈的支持，并且在耐心指导论文之余，认真负责地对实验和论文中出现的问题给予耐心的讲解，让我感受到了实验过程中的乐趣，培养了主动思考和独立动手解决困难的能力。

贾东杰学姐在我做实验的过程中认真地我的实验过程，使得实验能够顺利完成希望借此机会向段老师和贾东杰学姐表示衷心的感谢！参考文献：[1] McGranahan GH，Leslic CA，Uratsu SL．Agrobacterium mediated transformation of walnut influcences growth of apple rootstockM26[J]．Plant Cell Rep，2000，1049-1056．[2] James DJ， Passey AJ，Barbara DJ ，Bevan M．Genetic transformation of apple（Malus pumila Mill．） using a disarmedTi－binary vector[J]．Plant Cell Rep,1989,7：658-611．[3] 程家胜，Dandekar AM， Urastu SL．苹果基因转移技术研究初报[J]．园艺学报,1992,19（2）:101-104．[4]　Norelli JL，Aldwinckle HS．The role of Aminoglycoside Antibioticsin the regeneration and selection of neomycin phosphortransferase－transgenic apple tissue[J]．J Amer Soc Hort Sci，1993，118（2）：311-316．[5] 张志宏，景士西，王关林，方宏筠，吴禄平．新乔纳金苹果遗传转化及基因植株再生[J]．园艺学报，1997，24（4）：378-380 ．[6]　Puite KJ ，Schaart JG． Genetic modification of the commercial apple cultivars Gala，Golden Delicious and Elstarvir an Agrobacterium tumefaciens－mediated transformation method [J]．Plant Sci，1996，119：125-133 ．[7]　Schaart JG，Puite KJ，Kolova L，Pogrebnyak N ． Some methodological asp。