试验2纸色谱分离几种氨基酸.docx

实验五 纸色谱和柱色谱［实验目的］1. 掌握纸色谱的基本原理及其用途2. 学习柱色谱的基本原理及其用途，熟练掌握柱色谱的操作方法［实验原理］一、 纸色谱纸色谱是以滤纸作为载体，让样品溶液在纸上展开达到分离的目的纸色谱法的原理比 较复杂，主要是分配过程，纸色谱的溶剂是由有机溶剂和水组成的，在滤纸的一定部位点上 样品，当有机相沿滤纸流动经过原点时，即在滤纸上的水与流动相间连续发生多次分配，结 果在流动相中具有较大溶解度的物质随溶剂移动的速度较快，而在水中溶解度较大的物质随 溶剂移动的速度较慢，这样便能把混合物分开二、 柱色谱吸附柱色谱通常是在下端带有活塞的玻璃管（色谱柱）中填入固体吸附剂，从柱顶加入 混合物样品溶液，各组分被吸附在柱的上端，然后连续加入洗脱剂，样品在吸附剂上反复地 进行着吸附一解吸一再吸附一再解吸的过程,吸附时则停顿，解吸时则随着洗脱剂向下移动 由于各组分对于吸附剂的作用能力不同，向下移动的速度也不同，作用能力强的向下移动的 慢，作用能力弱的移动的快，随着洗脱过程的不断进行，各组分便得到了分离［实验装置］⑴终点施、图3柱色谱装置图1纸色谱1.层析缸2.滤纸3.展开剂图2纸色谱滤纸条点样［课前预习］柱色谱、纸色谱 ［实验步骤］一、纸色谱分离几种氨基酸本实验以饱和水的正丁醇溶液作展开剂，通过实验测出丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸的 Rf值，并分析测定未知试样的成分或组成。

1. 滤纸的选择滤纸的质量应厚薄均匀，能吸附一定量的水，可用新华 1 号，切成纸条，大小可自由选 择，一般为3X20 cm, 5X30 cm, 8X50 cm等滤纸用前应经过试验，观察分离效果，色点 边界清晰为好2．配置展开剂正丁醇：水：乙酸=4：5：1 （体积比）按他们用量比例，先将正丁醇与水在分液漏斗 中一起振摇10〜15分钟，然后加乙酸再振荡静置分层，下层弃去，上层作为展开剂，将 展开剂倒入层析缸内盖上盖，放置0.5 小时，使缸内形成饱和蒸气3．显色剂95份正丁醇及5份（体积比）2mol・L-i的CHgOOH混合作为溶剂，加入茚三酮配成）.1% 的溶液4.取5X30cm的滤纸一张，在距离一端2cm处用铅笔轻划一直线，在直线上用铅笔轻 轻地划4个“X”号，并注上号码1, 2, 3……，在各点上用毛细管（管口要齐）分别点上 谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸已知样，在第四点上，点上未知样，每加一点样品就用吹风机以 温热的风吹干，每个样品点三次将层析液倒在一培养皿中（约 1〜1.5cm 深），先将点好样的滤纸上端夹在支架上，下 端放在皿的外边（不要与溶剂接触），盖上层析缸盖10分钟后，滤纸吸附蒸汽达到平衡， 用夹子将滤纸下端迅速放入皿中，溶液因毛细现象逐渐向上渗透扩散，当前沿距样15cm左 右处停止展析，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前沿线。

晾干，喷上显色剂到刚好润湿滤纸，用 吹风机吹干，并在85〜90 °C烘干，则显出紫红色斑点1） 计算已知样和未知样各点的Rf值2） 根据已知样和未知样各点的R；值做定性分析二、柱色谱法分离偶氮苯与邻-硝基苯胺本实验是以小型层析柱分离偶氮苯与邻-硝基苯胺的少量混合溶液 所用主要仪器及药品为：层析柱：长25 cm,内径1 cm吸附剂：市售中性氧化铝（100目，11〜III级）10g淋洗剂：①1,2-二氯乙烷与环己烷等体积混合液80〜100mL，②95%乙醇（备用） 待分离混合样： 1 %偶氮苯的1,2-二氯乙烷溶液与1 %邻-硝基苯胺的 1,2-二氯乙烷溶液 的等体积混合液约 1 mL1）湿法装柱：将洗净晾干的层析柱中注入约为柱容积1/4的淋洗剂将淋湿的一小 团脱脂棉推入柱底狭窄部位（勿挤压太紧），上面加盖一张直径略小于柱内径的滤纸片将 10 g中性氧化铝在小烧杯中用淋洗剂调成悬浊状打开柱下活塞调节流速约1滴/秒，将制 成的悬浊液在自柱顶注入，可敲击柱身以使吸附剂沉积均匀在此过程中应始终保持吸附剂 沉积层上面有一段液柱吸附剂加完后关闭活塞，将一块滤纸片盖在吸附剂沉积面上2） 加样：打开柱下活塞放出柱中液体，待液面降至滤纸片时关闭活塞，将1 mL 待分 离的混合样液沿柱内壁加入。

打开活塞，待样液液面至滤纸片时关闭活塞用干净滴管吸取 淋洗剂约 0.3 mL 沿加样处冲洗柱内壁再打开活塞将液面降至滤纸处依上法重复操作直 至柱壁和顶部的淋洗剂均无颜色3） 淋洗和接收：加入大量淋洗剂，打开柱下活塞，控制流出速度为1 滴/秒观察柱 中色带下行情况随着色带向下行进逐渐分为两个色带，下方的为橙红或橙黄色，上方为亮 黄或微带草绿色，中间为空白带当前一色带到达柱底时更换接收瓶接收（在此之前接收的 无色淋洗剂可重复使用）当第一色带接收完后更换接收瓶接收空白带，当空白带按完后再 换接收瓶接收第二色带［注释］1.比移值（Rf）表示物质移动的相对距离例如：R =溶质移动的距离 f 溶液移动的距离3.0cmRf （化合物 A） = =0.25f 12cm各种物质的Rf随要分离化合物的结构、滤纸的种类、溶剂、温度等不同而异2. 柱色谱在接受色带时， 如果两色带间的空白带较宽，在第一色带到柱底时可改用95%乙 醇淋洗，以加速色带下行若空白带较窄，甚至中间为交叉带，则不可用乙醇淋洗，否 则将会使后一色带追上前一色带，造成混淆［思考题］1. 柱色谱操作中，如何选择洗脱剂？2. 都有哪些分离提纯有机化和物的方法？。