纤维堆囊菌合成埃博霉素几个关键问题的研究.pdf

山东轻工业学院 硕士学位论文 纤维堆囊菌合成埃博霉素几个关键问题的研究 姓名：王婷 申请学位级别：硕士 专业：发酵工程 指导教师：刘新利 2011-06-06 山东轻工业学院硕士学位论文 I 摘 要 粘细菌是一类以滑动方式运动，可以形成种类丰富、功能多样的生物学活性 物质，具有复杂多细胞社会学行为的革兰氏阴性杆菌粘细菌所具有的社会学行 为以及能够分化形成子实体结构的能力是区别于其他原核生物的主要特点 纤维堆囊菌是粘细菌中一类能够降解纤维素的生理类群， 具有极其优异的生 物学合成能力， 发现由其产生的的次级代谢生物学活性物质占到了从粘细菌中总 发现量的 48.4% 纤维堆囊菌的社会性行为表现为在生长过程中呈现出聚团生长 和细胞密度依赖性的特点，再加上纤维堆囊菌代时长达 16 小时，生长缓慢，这 些特性严重限制了纤维堆囊菌的分离纯化工作， 如纤维堆囊菌埃博霉素生物合成 改造后期突变株的分离纯化 在本文的工作中，我们以纤维堆囊菌为研究对象，在山东大学粘细菌与医药 微生物技术实验室建立的微包埋培养技术基础上将分散至单细胞状态的纤维堆 囊菌单细胞包埋在海藻酸锶凝胶球粒中，实现了对单个纤维堆囊菌细胞的包埋。

我们以被包埋的纤维堆囊菌菌株自身作为助长菌株， 对实验室前期得到的埃博霉 素诱变株进行包埋纯化最终我们得到了具备突变株遗传特性的、埃博霉素产量 存在显著差异的多个单克隆 微包埋技术克服了传统的分离纯化纤维堆囊菌效率 低、耗时长的弊端，大大加快了纤维堆囊菌次级代谢途径改造的工作进程，提高 工作效率 埃博霉素是纤维堆囊菌合成的一类具有促微管聚合活性的大环内酯类化合 物，由于其抗肿瘤活性成为人们研究的热点之一目前有多种埃博霉素类似物进 入临床评估阶段，其中 Ixabepilonelaos 已经在美国成功上市但是由于纤维堆囊 菌埃博霉素产量低，价格昂贵等因素制约了埃博霉素的生产，树脂就是其中一个 重要因素 目前不论是小型实验还是上罐发酵所用的埃博霉素吸附树脂都是美国 罗门哈斯进口的 XAD-16 大孔吸附树脂，这种树脂价格昂贵，用量较大，提高了 埃博霉素的生产成本本文分析了 40 种不同类型的国产吸附树脂对纤维堆囊菌 摘 要 II So0157-2 产埃博霉素的影响，结果显示其中 4 种可以提高埃博霉素的产量，一 种可以显著促进菌体的生长 复合树脂实验则证明不同优势树脂混合使用的效果 远大于单一树脂，其中大孔型强碱阴离子交换树脂 D202 与大孔吸附树脂 XD-5 以 3:7 比例混合使用效果最佳，可以使 So0157-2 的埃博霉素产量较 XAD-16 提 高 8.3 倍。

天然的埃博霉素主要以埃博霉素 A 和埃博霉素 B 两种形式存在，我们把产 生埃博霉素的菌株根据其 epothioneA/B 合成比例情况分为 epo B+和 epoB-两个种 类 通过比较 10 株纤维堆囊菌的 ATmodC2核酸、 氨基酸序列信息及同源建模蛋白 质 3D 结构水平的差异，找出四个可能会对 ATmodC2底物选择造成差异的氨基酸 位点（Val90,Ala91,Ala95,Ser196） ，这四个氨基酸位点在空间分布上均位于活性反应 中 心Ser94及Arg119的 附 近 我 们 将 这 四 个 氨 基 酸 位 点 突 变 为 Leu90,Val91,Ile95,Phe196，并进行 ATmodC2的 E.coli 异源表达及包涵体蛋白复性 ATmodC2酶活测定结果表明，这 4 个氨基酸位点的改变造成 ATmodC2对 methylmalony-CoA 的结合能力降低了近 80%而单一位点突变的 M95，M196反 应后 MM/M 为别为 0.58 和 0.30， 说明突变子结合甲基丙二酰辅酶 A 的能力分别 下降至结合丙二酰辅酶 A 的 58%和 30%， 从这个结果我们可以看到 196 位点 Ser 替换为 Phe 后对甲基丙二酰辅酶 A 的结合能力影响很大。

实验室前期工作中提 出的 2 个新位点 90,91 联合突变子 M90-91的 MM/M 值为 0.35， 说明这两个位点对 于甲基丙二酰辅酶 A 的结合确实有一定的影响，且影响程度与 95,196 位联合突 变子 M95-196相当 关键词关键词：纤维堆囊菌；埃博霉素；纯化；树脂；酰基转移酶 山东轻工业学院硕士学位论文 I ABSTRACT Myxobacteria are Gram-negative gliding bacteria, which exhibit complicated multicellular social behavior. They are capable of producing large numbers of bioactive compounds that have unique structures and diverse functions. Myxobacteria are unique among prokaryotes for their social behavior and the morphogenesis of fruiting bodies. Sorangium cellulosum is a species of celluloytic myxobacteria with a very excellent capacity of biological synthesis. The novel bioactive metabolic compounds discovered from Sorangium cellulosum strains occupied up to 48.4% of the total discoveries from myxobacteria,The social Sorangium cellulosum show typical social behaviors, such as cell density–dependent growth patterns and growing close together, Sorangium strains grow extremely slow, dividing once every 16 hours, and, as a result, Their characteristic of complex cooperative growth has been a barrier for separating Sorangium cellulosum , inhibiting the selection of Sorangium cellulosum mutants during the genetic engineering of the epothilone biosynthetic gene cluster, for example. In this work, we used Sorangium cellulosum as a model. A single S.cellulosum cell embedded into alginate gel micro-beads was able to be triggered to form single-cell colonies when the beads were co-incubated with a high concentration of unpacked S.cellulosum. On the basis of the developed method, we purified a S.cellulosum mutant to obtain single colonies using a S.cellulosum strain as the helper. Interestingly, we obtained single colonies with the genetic traits of the mutant. HPLC revealed that the colonies we purified had substantial differences in the production of epothilone. Compared to the new method, the traditional operation is time-consuming and inefficient. We have reason to believe that the method we established will accelerate the rate of progress and improve the efficiency of genetic engineering in ABSTRACT II S.cellulosum. Epothilones are 16-membered macrolides, produced by Sorangium cellulosum, that act on cancer cells by stabilizing microtubules, the same mechanism of action as Taxol. Biochemical, pharmacological, and clinical studies have shown that epothilones are highly promising agents for cancer treatment. Some epothilones, and their chemically modified derivatives, are in clinical studies. Ixabepilone,one derivative of epothilone, has been approved for clinical use by the U.S. Food and Drug Administration. However, There are several factors,such as low yield and high cost are constraining the cost of epothione production, the resin is an important factor.XAD-16 resin,bought by Rohm and Hass company is the only used in production of epothione,both in pilot experiment and large fermentation.The high price and large demand of XAD-16 resin increase the production costs. In this paper we survey the effect of 40 different domestic resins on epothilones yield of Sorangium cellulosum So0157-2. Four types of resins are proved to improve yield of epothilone while one can significantly promote cell growth. The mix of different advantageous resins has better effect on epothilone yield than single one. Exclusively, the mix of resin D。