芽孢杆菌的分离及芽孢杆菌制剂的制备.docx

芽孢杆菌的分离及芽抱杆菌制剂的制备［实验目的及要求］1. 掌握芽抱杆菌的分离方法，熟悉芽抱杆菌的分离原理2. 掌握芽抱杆菌制剂的制备技术［实验原理］1. 芽抱杆菌的分离原理利用芽抱杆菌以芽抱形式存在时具有耐高温的特点，将样品于80^高温处理20min,消 灭其它菌株，然后再分离芽抱杆菌［实验器材］水浴锅、土壤、各种培养基、营养琼脂平板、三角棒、250mL三角瓶、移液管、灭菌生 理盐水、试管等［实验内容与方法］1. 芽抱杆菌的分离⑴实验步骤① 取0.5g 土壤于3mL装有灭菌生理盐水的无菌试管中，振荡混匀② 将样品置80^水浴锅中处理20min③ 取1接种环样品于营养琼脂平板上按分区划线法进行划线，37°C培养20〜24h④ 取出培养平板，观察菌落特征⑤ 挑取单个菌落，涂片、革兰染色、镜检，观察是否形成芽抱⑥ 将镜检有芽抱的单菌落进行传代、纯化、保存备用⑵结果分离的芽抱杆菌革兰染色为革兰阳性、能形成芽抱的大杆菌2. 口服型芽抱杆菌制剂的制备⑴培养基的配制① 固体培养基葡萄糖 20g/L、蛋白胨 15 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO4 2 g/L、K2HPO4-3H2O 4 g/L，琼脂 20g/L，pH7.0，121C灭菌 20min。

② 摇瓶培养基葡萄糖 20g/L、蛋白胨 15 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO4 2 g/L、K2HPO4-3H2O 4 g/L， pH7.0,121C 灭菌 20min③ 优化培养基葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、NaCl 5g/L、KH2PO4 2 g/L、K2HPO4-3H2O 4 g/L、MnSO4 0.4g/L、MgSO4・7H2O 2 g/L ,pH7.0, 121°C 灭菌 20min⑵发酵① 一级发酵取一环活化的菌种，接入装液量为 100mL的摇瓶培养基的250mL的三角瓶中， 37C,160r/min 培养 24h② 二级发酵吸取10mL 一级发酵种子液，接入装液量为100mL的摇瓶培养基的250mL的三角瓶中 （接种量 10%, V/V）, 37C,160r/min 培养 18-24h⑶分装将检验合格的菌液进行分装⑷检验① 杂菌的检验取发酵后的菌液进行涂片、革兰染色及镜检，观察细菌的形态染色特点杂菌不得超过 1000 个/mL② 活菌数检测将发酵后的菌液涂片、镜检观察,（接种环应封口，直径约0.5cm，沾菌涂布约直径0.5-1cm 大小面积）判断标准：油镜下各视野平均细菌值为1-9个细菌，等于105-6/mL。

油镜下各视野平均细菌值为10-99个细菌，等于107-8/mL油镜下各视野平均细菌值为100以上个细菌，等于109」0/mL油镜下各视野平均细菌值为密集细菌，等于1010以上/mL芽抱杆菌制剂活菌数：不少于108个/mL3. 冻干型芽抱杆菌制剂的制备⑴培养基的制备5.5%豆饼粉、6.5%玉米粉，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，ddH2O 1000mL，121C高压灭 菌 30min⑵发酵按1%接种量接种菌液于上述高压后的培养基中，混匀，装入托盘厚度2cm，28-35C无 菌好氧发酵48〜72h，检测发酵后活菌含量，再用玉米粉调节至含菌108/g以上，菌液发酵 后于1:3无水碳酸钙混合后70C干燥，干燥后按2:8:90比例加入乳糖和可溶性淀粉，混匀， 粉碎，过筛包装，检验。