消灭PCR非特异性扩增的黄金方法.docx

2014-07-17 解螺旋PCR技术作为实验室的入门级技术，却经常困扰各位实验大神们虽然度 过了初学者们少加漏加PCR体系的阶段，但很多奋战在实验室一线的小伙伴正 遭遇着PCR非特异性扩增的尴尬事件为了解决这个问题，有多少人曾经把退 火温度从50°C试到70°C、重新合成过引物、换过模板、换过全新的电泳缓冲液, 或者还带着满腔的愤怒捏碎过电泳胶？今天老谈来教教大家如何对非特异性扩 增嗤之以鼻！by老谈给各位小伙伴脑补一下非特异性扩增，即进行PCR所扩增出来的条带不是 所要的，引物与模板在非目的条带处有错配，导致延伸产物不是目的条带例如 引物二聚体，即引物在退火过程中产生了 hairpin吉构或其他二级结构，或者引 物在模板的某些位置非特异性地结合，也同样会产生非特异性扩增我们都知道，PCR产物都是通过引物延伸产生的当引物产生了二聚体或 者非特异性扩增产物之后，引物本身就无法再延伸形成PCR产物了，这样的情 况下，非特异性扩增产物越是多，那目的产物就越是少如果在qPCR过程中, 就会在熔解曲线中形成双峰小伙伴们遇到这样的问题，首先想到的可能是加入DMS0 来阻止引物二聚 体形成，或者EDTA来调节体系的离子浓度。

但是具体问题具体分析，我们不能病急乱投医，这里老谈给小伙伴们整理了解决方法，希望可以帮助大家快速、 准确的搞定这个“小问题”1、 引物设计的过程中要用Primer premier 5.来验证一下二聚体；2、 引物合成后，先做一次梯度 PCR ，检测最合适的退火温度，一般高退火温 度可以提高引物对模板的特异性从而降低引物二聚体；3、 降低 Mg2+ 浓度，镁离子浓度高，会导致大量的非特异性扩增，但是没有镁 离子的话，也会导致 Taq 酶的失活；4、 降低dNTP浓度，dNTP也是非特异性扩增的一个罪魁祸首，降低它的浓度, 也能有效降低二聚体及其他非特异性扩增；5、 降低引物浓度，一般的PCR引物都是过量的，降低了引物浓度自然也能降 低引物之间形成二级结构的可能性；6、 提高退火温度，这个道理很简单，引物的退火温度提高，引物间的二级结构 形成可能性就会降低；7、 延长退火时间，这个也可以减弱引物间结合的可能性；8、 DMSO 及甜菜碱，这些 PCR 促进剂，主要是用于 CG 含量高的模板上，降 低 DNA 的二级结构的产生，但根据经验，加入 DMSO 之后需要同时提高一点 退火温度来补平（qPCR不太适用）；9、 热启动法，通过95 €的高温热启动，高温解链，使得引物间的二级结构破坏， 以此降低二聚体产生。

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