激光共聚焦显微镜.docx

胰腺细胞悬浮液样品 适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在 激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化原理：正常细胞内游离钙浓度［Ca2+］i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为 1.2-1.3 mmol/L,相差达10000倍胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙 震荡（钙峰或钙波）在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超 负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已 广泛应用于临床显而易见，测定［Ca2+］在生理学、病理学和药理学等研 究工作中均具有重要意义Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式 导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在 激发光作用下能产生特异的荧光荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而 变化方法：1•预先用二甲基亚砜（DMSO）将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20°C 避光保存F127用DMSO配制成20%溶液（W/V）用无血清无酚红培养 液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic F-127 备用。

2•移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2 遍,加入10 umol/L 染料液1 ml,置于37°C的CO2孵箱里避光温育30 min3•将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1 ml DMEM液后置于 20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某 一层面的荧光图像4.启动LSCM，选择488 nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp 2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30 sec）、扫 描次数（ 300 次），开始扫描5•将数据输入excel进行整理、统计、分析1） 如果直接做活细胞观察，可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上，然后培养,等观察时用镊子把盖 玻片取出,倒扣在载玻片上就行了.2） 需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察. 如果是用 探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出, 倒扣在载玻片上就行了. 买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据 大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小 孔中，罐流都可以的。

我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细 胞可种在大玻片上，这样透光好1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏你最好拿弱酸，如稀盐 酸浸泡2、然后灭菌，比如紫外照射，两面都照射，然后放于合适的孔板中，接种合适密度的细胞于孔板中，一般 较稀一些，那样容易有单个的细胞，得到较好的图片3、加抗体时最好能在封口膜上操作，那样很节约抗体，样品可以放到一个湿盒中，饭盒加水就可以了一 定要记住接种细胞的玻片面，别弄反了4、 在载玻片加上一滴，防淬灭剂，用甘油配制的DABCO,将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周 围再用指甲油或其它胶固定用锡箔纸报住，避光 4c 保存，最多一个月5、 最好染核，核好染，同时也便于观测6、先在普通荧光显微镜下观测你的结果，实验理想的话再去看激光共聚焦毕竟激光共聚焦很贵我做过 con focal，我个人觉得用con focal来看细胞的亚结构非常好我用的OLYMPUS的FV1000,我看过说明书介 绍，co nfocal可以做离子浓度的测定，但是我没有做过组织的切片一样可以做con focal,我的一个朋友就 是做的组织，方法和做细胞的荧光一样，结果不错。

我当时做的是细胞的免疫荧光，方法和基本的免疫荧光一样，细胞种在载玻片上， 60%融合就好，不要长 满，因为细胞太多，挤在一起的话，会影响成像一抗，荧光二抗，依次孵育我把我毕业论文中的一张 图贴上来给大家看看我做的是双染，一个抗体用的FITC（绿色），是一种微管蛋白；另一个用的是TRITC, 是一种结构蛋白黄色是两种融合的图像，结果发现这两种蛋白结构上共地位是否要con focal和免疫组 化都做要取决于实验的具体检测指标和实验的目的，比如检测核因子等转录因子，静息状态时核因子 kb 存在于细胞浆，刺激时进入细胞核，这样用激光共聚焦的共定位技术就可以很清楚的指示出来，而免疫组 化只能粗略的看出组织切片的自发荧光应该是限制了荧光标记技术在这一方面的应用，所以不做任何处理， 在荧光显微镜下 都可以看到荧光，处理这样的情况一是选用不同的标记荧光尽量避开自发荧光，也有些去除自发荧光的措 施，要具体情况具体使用了当然不排除有些文章纯粹为了 con foca l而con focal，其实能用简单的实验说明问题了就不要选用复杂的了， 免疫组化的定位显示在发国外论文的时候还是很受重视的免疫荧光组织化学技术一、 免疫荧光组织化学技术的发展史概述 二、 免疫荧光组织化学的原理 （一） 直接方法 1． 检查抗原方法……………………………………………………………………2． 检查抗体方法……………………………………………………………………（二） 间接方法 1 •检查抗体（夹心法）方法 2．检查抗体方法 ……………………………………………………………………3•检查抗原法 （三） 补体法 1 •直接检查组织内免疫复合物方法 2•间接检查组织内抗原方法 （四） 双重免疫荧光组织化学标记方法 （五） 对照试验 1 • 直接方法 …………………………………………………………………………2. 间接方法 3. 补体方法 三、 荧光抗体的制备 （一）荧光素 ………………………………………………………………………………1． 异硫氰酸荧光素 …………………………………………………………………2． 四甲基异硫氰酸罗达明 …………………………………………………………3. 得克萨斯红（Texas red） 4•其它荧光素 （二） 荧光素标记抗体的方法 ……………………………………………………………1. FITC 标记抗体的方法……………………………………………………………2•四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法 3•藻红蛋白标记抗体方法 4•蓝色荧光素标记抗体方法 （三） 荧光抗体的质量控制 ………………………………………………………………1•染色特异性和敏感性的测定方法 2. F/P比值的测定方法 3•荧光抗体的保存 四、 免疫荧光组织化学染色方法 （一） 荧光抗体染色方法 1 •直接方法 2 •间接方法（双层法） 3•间接方法（夹心法） 4. 补体方法 5•膜抗原荧光抗体染色方法 6•双重染色方法 7•荧光抗体再染色方法 （二） 荧光抗原染色方法 五、 荧光显微镜检查方法 （一） 荧光和荧光显微镜 （二） 荧光显微镜标本制作要求 1 •载玻片 ……………………………………………………………………………2•盖玻片 3. 标本 4•封裱剂 5•镜油 （三） 使用荧光显微镜注意事项 （四） 荧光图像的记录方法 六、 非特异性染色的消除方法 （一） 非特异性染色的主要因素 （二） 消除非特异性染色的方法 1 •葡聚糖凝胶G-50柱层析法 2. DEAE纤维素柱层析法 3•荧光抗体稀释法 4•纯化抗原方法 5 •纯化抗体方法——免疫吸收方法 6•伊文氏蓝（Eva ns blue）衬染色方法 七、 现状与展望 一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述 免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由 Coons 和他的同事（1941）建立，免疫 荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。

它与葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵 白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技 术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter （FACS）的 应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域 细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确 80 年代到 90 年代相 继又有新的荧光素出现如R-藻红朊，B-藻红朊，C-藻青蛋白，cy2, cy3, cy5, cy7均在流式细胞仪和激光共 聚焦显微镜中广泛应用 由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、 肿瘤学以及临床检验等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用二、免疫荧光组织化学的原理免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体 （或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标 记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子 的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），利用荧光显微镜可以 看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量（图 3-2-1）。

图 3-2-1 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方 法称荧光抗原法免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法一）直接方法1． 检查抗原方法 这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织 抗原的检查此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一 种抗原，敏感性较差图 3-2-2）图 3-2-2 直接法2． 检查抗体方法 将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来二）间接方法1．检查抗体（夹心法）方法 此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的 抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法2．检查抗体方法 用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上， 再用间接荧光抗体（抗种属特异性 IgG 荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗 体反应部位呈现明亮的特异性荧光。

此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段3．检查抗原法 此法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体， 再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原 -抗体-荧光抗体的复合物同直接法相比荧光亮 度可增强 3 或 4 倍此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生 的多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术三）补体法 1．直接检查组织内免疫复合物方法用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原-抗体- 补体—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法 常用于肾穿刺组织活检诊断等2．间接检查组织内抗原方法常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片。