八微生物的遗传变异.ppt

第三节 基因重组和杂交育种,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传物质分子重新组合，形成新遗传型个体的方式，称基因重组重组可使生物体在未发生突变的情况下，产生新遗传型个体  真核微生物中的有性杂交、准性杂交及原核生物中的转化、转导 、接合和原生质体融合等都是在分子水平上的重组 基因重组是杂交育种的理论基础由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本 ，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步一.原核微生物的基因重组  在原核微生物中，基因重组主要有转化、转导、接合和原生质体融合4种形式 （一）转化(transformation)：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换 ，把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象称为转化 能进行转化的细胞必须是感 受态的受体菌最易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态处于感受态的细胞，其吸收DNA的能力，有时可比一般细胞大一千倍感受态的出现受该菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件等的影响例如，肺炎双球菌的感受态在对数期的后期出现，而芽孢杆菌属则出现在对数期末及稳定期。

转化后的受体菌，称为转化子来自供体的DNA片段称为转化因子，其一般是双链DNA片段调节感受态的一类特异性蛋白称为感受态因子 转化的频率通常为0.1%~1%，最高为20%能发生转化的最低DNA浓度极低，为化学方法无法测出的10-5µg/mL如果把噬菌体或其他病毒的DNA(或RNA)抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒后代，这种现象称为转染(transfection) 它与转化不同之处是病毒或 噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何转化因子的交换，最后也不产生具有杂种性质的转化子 （二）转导（transduction） 1、转导：通过缺陷噬菌体的媒介作用，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transducant）,2、分类 ⑴普遍转导：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍转导 ①完全普遍转导：简称完全转导（complete transduction），由完全不含噬菌体自身DNA的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源DNA片段导入受体细胞内。

②流产普遍转导：简称流产转导（abortive transduction），经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导⑵局限转导： 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象特点：①只能转导供体菌的个别特定基因(一般为噬菌体整合位点两侧的基因)；②该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；③缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率(10-5左右)“误切”，或由于双重溶源菌的裂 解而形成，在后一情况下可形成50%缺陷噬菌体；④局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素的诱导并引起裂解后才产生 ①低频转导：通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，只形成极少数（10-4—10-6）转导子 ②高频转导 ：对双重溶源菌进行诱导，能产生高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，可获得50%的转导子⑶溶源转变：温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变 溶源转变与转导的区别：①不携带任何外源基因的正常噬菌体②是噬菌体基因而不是供体菌的基因提供了宿主的新性状③新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子④获得的性状可随噬菌体的消失而消失。

（三）接合（conjugation） 1、接合：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合通过接合而获得新性状的受体细胞，就是接合子（conjugant）2、分类：根据细胞中是否存在Ｆ因子以及其存在方式的不同，可把E.coli分成以下四种相互有联系的接合型的菌株 ①F+ （“雄性”）菌株：含有F 因子，有性菌毛 ②F-（“雌性”）菌株：在这种细胞中没有F因子，表面也不具性菌毛它可通过与F+菌株或F′菌株的接合而接受外来的F因子或F ′因子，从而使自己成为“雄性”的菌株，同时还可接受来自Hfr菌株的 一 部分或全部染色体信息 ③Hfr（高频重组，high frequency recombination）菌株：因为Hfr菌株与F-菌株接合后发生重组的频率要比F+与F-接合后的重组频率高出数百倍，故名 ④F′菌株：当Hfr菌株内的Ｆ因子因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的但携带一小段染色体基因的特殊Ｆ因子，称F′因子携带了F′因子的菌株，其遗传性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F′菌株（primary F′-strain）。

四）原生质体融合（protoplast fusion） 1、原生质体融合：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合 2、原生质融合的一般操作步骤为： （1）、选择具有遗传标记的亲株 为了有利于重组子的检出，必须选择已知的或用诱变方法获得的营养缺陷型或抗药性标记菌株作为亲株，同时要求标记必须稳定 （2）、原生质体的制备 选择合适的酶系进行细胞脱壁，细菌多用溶菌酶，真菌多用纤维素酶，酵母菌用蜗牛酶等 （3）、原生质体融合 把二亲株原生质体混合在一起，用PEG（聚乙二醇）助融，然后将融合子涂布在再生平板上，保温后检出重组子 PEG的助融作用是原生质体能够高频融合重组的重要条件PEG的作用机理还不清楚4）、再生 再生是一个十分关键的问题，因为不同微生物的原生质体所要求的最适条件不同 （5）、重组子的检出 融合子重组的测定，通常采用染色体标记的遗传重组来检测，如二亲株的遗传标记为营养缺陷型A+B-及A-B+，则其重组子应为原养型A+B+ 检出重组子一般可用二个方法： 直接法：将融合液涂布在不补充二亲株生长所需营养物或补充有两种药物的再生平板上，直接筛选出原养型的或双重药物抗性的重组子； 间接法：将融合液涂布在丰富的再生平板上，使亲株及重组子都再生而长成细胞，然后用影印法或牙签法转到选择性培养基上检出重组子，此法对某些有表型延迟作用的遗传标记，较直接法有利，不至于因直接筛选而产生干扰。

6）、原生质体频率、原生质体再生频率和融合率的计算,一、 基因工程(gene engineering)是指在基因水平上的遗传工程，是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入到受体细胞中，让外源基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而产生出人类所需要的产物，或获得新的生物类型这种获得新功能的微生物称为“工程菌” 二、基因工程的基本操作步骤： 1、目的基因的取得 在进行基因工程操作时，首先必须取得有生产意义的目的基因，一般有三条途径： ①从适当的供体细胞（各种动物、植物及微生物均可）的DNA中分离； ②利用反转录酶的作用由mRNA合成cDNA； ③由化学方法合成特定功能的基因第四节 基因工程,2、载体的选择 有了目的基因后，还必须有符合要求的运送目的基因的载体，以便把它运载到受体细胞中进行增殖和表达载体必须具有几个条件： ①是一个有自我复制能力的复制子； ②能在受体细胞内大量繁殖，即有较高的复制率； ③载体上最好只有一个限制性内切酶的切口，使目的基因能固定的整合到载体DNA的一定位置上； ④载体上必须有一定的遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来。

目前有条件作为载体的，对原核受体细胞来说，主要有细菌质粒和λ 噬菌体两类对真核生物来说，主要有SV40病毒3、目的基因与载体DNA的体外重组 用同一种限制性内切酶处理目的基因和基因载体，可以形成相同的粘性末端，然后，将外源目的基因和载体DNA混合，在添加DNA连接酶，在一定条件下作用，便可以使目的基因与载体经过“退火”和连接的步骤形成重组DNA 4、重组载体引入受体细胞 目前使用最广泛的受体微生物有大肠杆菌、枯草杆菌和酿酒酵母 把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多，若以重组质粒作载体时，可以用转化的手段；如以病毒DNA作为重组载体时，则要用感染的方法第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退 1、菌种衰退的现象： 由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象 常见的菌种衰退现象，表现在以下几个方面： （1）原有的形态性状不典型 （2）生长速度变慢，产生的孢子变少 （3）代谢产物的生产能力下降 （4）致病菌对宿主的侵染能力下降 （5）对外界不良条件抵抗力下降 2、菌种衰退的原因 （1）有关基因的自发突变 （2）育种后未经很好的分离纯化 （3）培养条件的改变 （4）污染杂菌,3、防止衰退的措施 （1）尽量减少传代次数 减少传代次数，可以降低自发突变的几率，这样就减少了菌种发生退化的机会。

（2）利用不易衰退的细胞传代 （3）选择合适的培养条件 （4）采用好的菌种保藏方法 二、菌种的复壮 如果确知某菌株已发生衰退，那么必须经过复壮提纯后，才能保证生产上的需要 1、纯种分离 2、通过宿主复壮 3、淘汰已衰退的个体,三、菌种的保藏 一个优良菌种被分离选育出来以后，必须保持其优良性状稳定地遗传下来，不要发生退化变异、杂菌污染然而变异又是绝对的因此，采用好的保藏方法，把优良菌种妥善地保藏起来，尽量做到不死、不衰、不污染，不降低生产性能，对研究和利用微生物来讲，是一件十分重要的工作 1、菌种保藏的基本原理 菌种保藏的基本原理是：根据微生物的生理、生化特点，选用优良菌株，最好是它们的休眠体，人工地创造适合于休眠的环境条件，即干燥、低温、缺乏氧气和养料等，使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的2、菌种保藏的常用方法 一种好的菌种保藏方法，首先应能长期保持菌种原有优良性状不发生变异，同时也应考虑到方法本身的简便和经济 （1）斜面冰箱保藏法 将菌种接在适当的斜面上，待其生长丰满后，可放在4℃冰箱中保藏此法一般可保藏3个月左右，各类菌种均可用此法进行保藏 （2）半固体穿刺保藏法 将菌种接入半固体直立柱中，然后进行培养。

待长好后，放入4℃冰箱中保藏此法可保藏半年左右，它适用于细菌、酵母的菌种保藏 （3）石蜡油封存法 如果将无菌石蜡油加入到上述保藏的菌种中，使菌种与空气隔绝，则保藏效果更佳，一般可保藏1年左右根据同样的道理，用灭菌的橡皮塞代替棉花塞，效果更好 此法适用于各类菌种的保藏4、砂土管保藏法 取过筛（60目）河砂，用10%盐酸浸泡，用水洗净后，烘干再取瘦土，以4：1量混合，装入小试管、灭菌后，滴入几滴菌种悬液，用接种针搅匀然后放入干燥器中，抽气干燥，放入低温保藏此法一般可保藏1至数年 它适用于产生孢子的微生物的保藏 5、冷冻干燥保藏法 将用灭菌牛奶做成的高浓度的菌液装入灭菌的安瓿瓶中，放在低温条件下抽气干燥，使其中的水分因升华作用逸出，而形成完全干燥的菌块，然后将安瓿瓶在真空条件下融封这种方法因菌体内的水分全部被抽掉，无法进行任何代谢作用，所以保藏期很长，一般在5年以上 它适用于各大类微生物的保藏在国际著名的美国ATCC(American Type Culture Collection)中，目前已改为仅采用两种最有效。