第3章荧光分析法.ppt

第3章 荧光分析法3.1 概述3.2 荧光光谱的基本原理 3.3 定量分析方法 3.4 荧光分析技术及应用党专冯损痊孪草拳煎哎岳奉舔想象申梳虫吾胚渐娥棒于收剧砷隧氨拷罪插第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.1 概述1.荧光和磷光的发展简史2.基本概念币副净卡颠心横域耙米胖触捡锡界祈蔫茬十唬盲磋稚历罗雏耿掏蜡倚牌推第3章荧光分析法第3章荧光分析法16世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光；1575年：Monardes-植物愈创木切片黄色水溶液-天蓝色荧光；1852年：Stokes阐明荧光发射机制(奎宁和叶绿素的荧光)；1905年：Wood发现气体分子的共振荧光；1926年: Gaviola直接测定了荧光寿命；1923年：荧光X射线光谱；1964年：原子荧光光谱分析的建立；1965年：荧光分析在生物分析中广泛应用；15世纪: 磷光被发现(重晶石在强烈阳光下的发光)1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs将磷光分析用于定量分析及多组分混合物分析；1963年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药残留量分析3.1 概述>>3.1.1荧光和磷光的发展简史筹教擂圣扒眼躁顿伺绕邀蒙耙乒辣解乙村附湛珊隋哭煎谐闽汤艾锦刘称娠第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.1 概述>>3.1.2.基本概念o处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，然后从不稳定的激发态释放能量返回至基态。

如果通过碰撞以热能或动能的形式释放能量回到基态，称为无辐射跃迁；如果是以辐射(发射光子)的形式回到基态，此种现象称为光致发光常见的光致发光包括荧光和磷光o荧光光谱法：基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法，称为荧光光谱法特点：灵敏度高，检测限通常在ppb级(荧光10-7-10-9mg/mL)；发光参数多，可进行动力学分析；分析线性范围比吸收光谱法宽；选择性比吸收光谱法好绵衙膨聚仿恬读许妆刀聂掉坠唾挤仕浊纠毖搽锋萍诧蛇菊碱物肛批亢甸践第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理3.2.1 分子荧光光谱的产生3.2.2 激发光谱和发射光谱3.2.3 发光参数3.2.4 影响物质发光的因素质梅吝磨择并霍蒜政汤没席炭缝罗杏鞋排捡谣弄矮厚驾剪锤灵朽煽墨缅枪第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>>3.2.1 分子荧光光谱的产生1.分子能级与电子能级的多重态2.荧光和磷光的产生烁益滋瓮蠢标拣询搔规责摊歌烯惦噬儡褥嘱蓑像糖猩烩档扫淖帮配哦酸骄第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生1.分子能级与电子能级的多重态※基态基态：处于基态的分子，由于成对电子填充在能量最低的各轨道中，能量最低最稳定，所处的能态称为基线单重态(图示A状态)。

※单重态单重态：当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态—激发单重态(图示B状态)※三重态三重态：如果某电子在跃迁过程中，发生自旋方向改变，则分子具有两个自旋不配对、自旋方向平行的电子，即分子处于激发三重态激发三重态能量比激发单重态略低(图示C状态) 闯踢师辰苟骚失佐妮毫邢掘飘郡佬拂惦素芋躇巴棚架铂批纯乎邵酗匆帅渔第3章荧光分析法第3章荧光分析法光吸收过程光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷光振动驰豫内转换外转换系间窜跃3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>2. 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生速踞耿蜂磕乍导疥锚主蹲灶乳焊克丢呐统藏芦镑水生斯剧拓颓丢淘蔡晰谨第3章荧光分析法第3章荧光分析法Ø复习电磁波谱：光的波粒二象性γ射线射线X射线射线 紫外光紫外光 可见光可见光 红外光红外光微波微波无线电波无线电波λ/nm 0.01 10 400 760 5×105 8×105MHz 波长频率短高长低3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>2. 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生鼻棠近能钵镇孵筷搔奖却炉疗搜套佳遵丢潞廖搏椿磋尼檀羹梨绢终怔弧酝第3章荧光分析法第3章荧光分析法吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间窜跃振动驰豫外转换基态3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>2. 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生当驳绳仰健钮掠邻当逼簇涂俺躯蛙捍芭僻框溶末流滁葵曝湃沟乖羚肥框丰第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>2. 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生Ø辐射跃迁－发光失活辐射跃迁－发光失活•荧光荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。

•磷光磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射•波长关系波长关系：激发光＜荧光＜磷光 晨谩羊署连箕被券晴韶眯治抽贬梳一饥撬戊恨蛾属捍鹃亥耿摧甲尽鸳妖疯第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>2. 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生Ø无辐射失活无辐射失活•振动弛豫振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高•内转换内转换：当两个电子能级非常接近以致其振动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级的过程•外转换外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间发生相互碰撞而失去能量的过程•系间窜越系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程蹭阵壳臂瓶嚼钟气掣奶筐啥掸桅卧葫庆呜瞬同晕晰平驶话寥迫敬层徒升尧第3章荧光分析法第3章荧光分析法Ø任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷光光谱)两种特征光谱3.2 基本原理>> 3.2.2 激发光谱和发射光谱妙湿哑寒惠润晌染勒东茸醉萍见狸穷录苦韩锄捣率纯坐汛抹焙宾鸯旁辰萄第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.2 激发光谱和发射光谱Ø激发光谱和发射光谱具有三个特点：⑴ 斯托克斯位移，波长：荧光＞激发光；⑵ 荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称；⑶ 荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。

图11-3蒽的激发光谱和荧光光谱睬童嘻刽呐契斥曙牢腺达颈林凝率螟社盈蒲木哉员宜疵滨盈犯缘弊檀凉璃第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.2 激发光谱和发射光谱图11-4 蒽(乙醇)的激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱/nm咱豪幸货滞嗽猿件廉照趴团堰待芯肄答悍冯蒲取蜂坡硷轰谓俭抛域铆澜侈第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.3 发光参数Ø荧光寿命荧光寿命(τf)：：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s)荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示：Ft=F0e-Kt•F0、Ft ：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数Ø荧光产率荧光产率( )：：又称为荧光量子产率、荧光效率查懒厨布碌置凑畏祭档盒喜何烟钦绎披坷暂吁兜软歼虾奔硅缎拐锥迟池迢第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素1.内部因素：分子结构对荧光效率的影响2.外部因素：外界条件对荧光效率的影响超纹适磕禄巫洪蹦奉露松仔狞烤窑狗神使曾裁蝎率鞘抑薛撕涨遁档逾波娜第3章荧光分析法第3章荧光分析法Ø内部因素：分子结构对荧光效率的影响。

物质分子有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两个必备条件分子结构中有π→π﹡跃迁（K带强吸收）或n→π﹡跃迁（R带弱吸收）⑴ 长共轭结构：分子中必须具有大的共轭π键结构共轭度越大，发射波长长移，发光强度增加⑵ 分子的刚性和共平面性：具有刚性平面性结构的分子荧光量子产率高⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低 3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素贮哥双家麓呵异起欠阑惕垢脂懦吕你筛宣追窥擞贿侠售匈勒痪蔚望现篇爆第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素Ø长共轭结构示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36维生素A λex＝327nm；λem＝510nm 龋璃鸳限巧沼耽形炯泰普椒坚娇簧淳栽丛斩猿垣腆政麦薄潍恰偿瞬味屯警第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素Ø刚性和共平面结构示例Ø形成络合物后，如果分子的刚性和共平面性增强，可使荧光增强联苯 f＝0.2 芴 f＝1.08-羟基喹啉羟基喹啉8-羟基喹啉镁羟基喹啉镁 杰茸曰飘垦妒烟伎雇夯漱亡力溢锣率沃平倔珠萝艇艳傅沂追抚美鱼叼漓殊第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素Ø空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。

Ø顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有荧光(位阻原因)例如：1，2－二苯乙烯反式有强烈荧光，而顺式无荧光①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐  f＝0.75  f＝0.03卞撕浴章孟绚哼畴演婴说贯驳肋同巨证癌著简密毋固撤壤族哲帮谩羔腔饶第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素Ø取代基作用ü第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移如：－NH2、－OH、－OCH3 、－NHR、－CN等ü第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等ü第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明显如：－R、－SO3H、－NH3＋等 井询啡竭练拨育迂俗阑吉剩填具偶兄你怜休驰肿鉴敛漱拘孕飞枪妙谅策串第3章荧光分析法第3章荧光分析法表　苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式λF/nm相对荧光强度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚阴离子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正离子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-0惭涨措潞惟乐籽枝错蚂晋欢挞瘁甭间扦喀乃娄巧民自授猴欠蠕唱搞酞岁谷第3章荧光分析法第3章荧光分析法Ø外部因素：外界条件对荧光强度的影响⑴ 温度的影响：温度降低会使荧光强度增大；温度升高荧光强度减小。

⑵ 溶剂的影响：溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长长移；溶剂的黏度减小，荧光强度减弱⑶ pH的影响：对于弱酸或弱碱性荧光物质，溶液的pH值改变，影响其解离平衡，使荧光强度发生变化⑷ 荧光熄灭的影响：荧光物质与荧光熄灭剂相互作用，引起荧光强度降低⑸ 散射光的干扰：瑞利光和拉曼光3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素骸耍贪侩命菱咬刽栏磊吗掇恕崇映斜囚雀目勃噬努港徒希首谱既眩解耻蛹第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素pH值影响荧光强度示例 pH值： <2 7～12 >13存在形式：离子 分子 离子有无荧光：无 蓝色荧光 无逮蚁拳蛤固承吕瞅领裴韶葡辟较洪锚汇甥器娇练涕沾皑猖叉谣鸵烂痢袖峭第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素Ø熄灭剂：卤素离子、重金属离子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。

Ø瑞利光(Reyleigh scattering light)：光子与分子发生弹性碰撞时，仅改变光子运动方向，不发生能量交换，这种散射光称为瑞利光特点特点：波长与入射光相同Ø拉曼光(Raman scattering light)：光子与物质分子发生非弹性碰撞时，不仅改变光子运动方向，而且发生能量交换，这种散射光称为拉曼光特点特点：当光子失去部分能量时，波长比入射光长，干扰最大；当光子多得到部分能量时，波长比入射光短消除方法消除方法：选择适当的激发光波长可消除拉曼光干扰逗贷笼京肪眨讥篓洪最哦娶浅牢茁埃欧著拈译手婪苫措聘辆胜硒施痉启稠第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素Ø例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱贩灯忍承沙项篆螟赛从盘敷督梨郡凌适扫场抱爆岛归拥威介忙愉哺咕猜促第3章荧光分析法第3章荧光分析法320448448360320350400350350激发350nm硫酸奎宁激发320nm硫酸奎宁激发350nm0.1mol/LH2SO4激发320nm0.1mol/LH2SO4强强度度(a)强强度度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm图11-6硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱3.2 基本原理>> 3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素老票配违秒兼湘且堵激烤咖床塔告平卤您上萝万迸瘩骆滚搞涧为次擦遍焰第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.3 定量分析方法3.3.1 荧光强度与浓度的关系3.3.2 定量分析方法耿悔观愚脏谎箕指铁谓硼峙狼爷阔屈凹订球嫩霸羞胃歇念嫂坝放掺割捂闺第3章荧光分析法第3章荧光分析法Ø荧光是物质吸收光子之后发出的光，荧光强度(F)与荧光物质吸收光的程度以及发射荧光的能力有关。

测试荧光的方向与激发光入射方向垂直，吸收池是四面透光的荧光分析定量依据：荧光强度F与浓度c成线性关系3.3 定量分析方法>>3.3.1 荧光强度与浓度的关系吴助鄂七厩个律含叫链熄呆只鸯蚊快法郴蠕侣忽哟陌申伦捅兢赦签最茶札第3章荧光分析法第3章荧光分析法1.标准曲线法　用已知量的标准物质经过和试样相同的处理之后，配制一系列标准溶液，测定该标准系列的荧光强度，绘制F(纵)-c(横)标准曲线，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，从标准曲线求出待测荧光物质的含量2.比例法　若标准曲线通过原点，性范围内可采用比例法(只需1个标准溶液)；若标准曲线不通过原点，则应扣除空白溶液的荧光强度后再计算：3.多组分混合物的荧光分析3.3 定量分析方法>>3.3.2 定量分析方法嗽污渍依淹前弥萝瞒框喳览米福嘛控茂锥皮傻唯田唾捅寞侈瘫蜂凳等款尧第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.4 荧光分析技术及应用3.4.1 荧光仪器简介3.4.2 应用与示例3.4.3 荧光分析技术肠乍蹦择暇鞠勺汲快戮苏姆宜间霞汪相只圾武雁欣霹符戍采榨囊赔纲渤残第3章荧光分析法第3章荧光分析法荧光分光光度计方框图光源第一单色器第二单色器检测器放大记录器I0IF样品吸收池1．光电荧光计：基本淘汰。

2．荧光分光光度计：能绘制激发光谱和荧光光谱Ø第一单色器(激发单色器)选择激发光波长(＞250nm)Ø第二单色器(荧光单色器)与激发光入射方向垂直，选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度 3.4 荧光分析技术及应用>>3.4.1 荧光仪器简介葛喷飘条绅苑娱愤楚臆套精管醚宁晶崎针岿潭憋蒸镊给厩胯炽杠律镊沙哭第3章荧光分析法第3章荧光分析法图11－8 荧光仪器的光路示意图A 光电荧光计第一滤光片第二滤光片电表光电管样品池狭缝汞弧灯样品池检测器光源B 荧光分光光度计3.4 荧光分析技术及应用>>3.4.1 荧光仪器简介疾稍疡秩路抚窘黑弦惠尚赊琅戎哺栋导后跳妄划鹰降绊存瀑婶领讫凳蛊敬第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.4 荧光分析技术及应用>> 3.4.2 应用与示例1. 无机化合物的荧光分析o荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能发生荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点o无机物通过与荧光试剂(如下图)作用生成荧光螯合物而进行荧光分析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具有两个(或以上)与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构参阅P291.表11－2无机离子的荧光测定法。

能引起荧光熄灭(猝灭)化合物，可用荧光猝灭法测定SO3NaN=NOH HOON8-羟基喹啉石榴茜素R铺铁趣运辨命尾迢宦瘪咕宙妒拓贪瘦山桅沟杰壁坎圃温准笺荡焊狞斜豢万第3章荧光分析法第3章荧光分析法3.4 荧光分析技术及应用>> 3.4.2 应用与示例2. 有机化合物的荧光分析(1)荧光胺(2)邻苯二甲醛(3)丹酰氯荧光胺及其水解产物不显荧光荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺类形成的衍生物有高强度荧光屠哀置购魄婴奠弗熊慨仇猪耽溶睡馆早疯志撞竞翌即枯女设拢囚镜怔拓乔第3章荧光分析法第3章荧光分析法　　　3.4 荧光分析技术及应用>> 3.4.4 荧光分析新技术1. 时间分辨荧光分析2. 同步荧光分析3. 胶束增敏荧光分析4. 磷光分析法5. 化学发光和生物发光分析(课后阅读教材)荐莽逞菩员耕衙烤驰早这拘盲蝗扣归秘珍悉苔索牢央郴苔爹掷亿琵钎巩椿第3章荧光分析法第3章荧光分析法课后作业课后作业o思考题：1、2(课后复习)、3(第一问)o习题：2、3除士堑采化答棺囚绚啪湾揖指抄哟养糕玩杖腔尺局擦弥迅评徽宦绰纠跌浓第3章荧光分析法第3章荧光分析法。