发育生物学课件1introduction.ppt

Developmental Biology发育生物学发育生物学Developmental Biology第一章第一章 序序 言言•一、前言• (一) 概念• 发育生物学是一门研究生物体从精子和卵子发生、受精、发育、生长到衰老、死亡规律的科学• 发展基础：胚胎学、遗传学、细胞生物学• 发展过程：形态 机理• 组织器官 细胞 分子Developmental Biology本课程的主要讲授内容本课程的主要讲授内容H序言：发育生物学中的一些基本原理；发育生物学序言：发育生物学中的一些基本原理；发育生物学中的动物模型；发育生物学中的现代技术中的动物模型；发育生物学中的现代技术H胚胎的早期发育：卵裂、原肠作用、神经胚作用胚胎的早期发育：卵裂、原肠作用、神经胚作用H细胞分化的机制：侧重基因表达的调控对组织器官细胞分化的机制：侧重基因表达的调控对组织器官形成和分化的影响形成和分化的影响H果蝇躯体轮廓发育的分子机制果蝇躯体轮廓发育的分子机制H四肢动物的肢体的发育四肢动物的肢体的发育H性别决定与生殖细胞性别决定与生殖细胞Developmental Biology主要参考书主要参考书1.Scott Gilbert编:《Developmental Biology》，6th Editions, 2000.2.Lewis Wolpert主编：《 Principles of Development》，1998.3.Klaus Kalthoff:《Analysis of Biological Development》，2nd edition, 2001.4.Bruce M. Carlson: 《Human Embryology & Developmental Biology》, 2nd Edition,1999.Developmental Biology发育生物学相关期刊发育生物学相关期刊Developmental Biology•(二)、发展历史•1、后成论(epigenesis)和先成论(preformation)之争• 希腊哲学家Aristotle在公元前第4世纪在对鸡胚和一些无脊椎动物胚胎观察后提出胚胎发育的两种假设：• Preformation:生物个体的一切组成部分都早就存在于胚胎中，各个部分随着胚胎的发育而长大。

•Epigenesis: 在胚胎的发育过程中，各种结构是逐渐形成的Developmental Biology17世纪，意大利胚胎学家世纪，意大利胚胎学家 Marcello Malpighi观察到的观察到的鸡胚鸡胚Developmental Biology17世纪，精原学说的代表人世纪，精原学说的代表人物物Nicholas Hartsoeker所想所想像的精子中的微型人像的精子中的微型人法国科学家法国科学家Bonnet(1745)提提出胚胎发育套装论出胚胎发育套装论Developmental BiologyH19世纪世纪30年代末：年代末：Mathias Schleiden和和Theodor Schwann提出细胞学说提出细胞学说H1840, August Weismann提出了生殖细胞论，认为后代提出了生殖细胞论，认为后代个体是通过精子和卵子继承亲本描述躯体特征的信息；个体是通过精子和卵子继承亲本描述躯体特征的信息；卵子是一个细胞，其分裂产生的细胞可分化出不同组织，卵子是一个细胞，其分裂产生的细胞可分化出不同组织，从而否定了从而否定了preformation论H19世纪对世纪对Sea Urchin受精卵的观察发现，受精卵的观察发现，受精卵含有两受精卵含有两个细胞核，并最终合并为一个细胞核，表明个细胞核，并最终合并为一个细胞核，表明细胞核含有细胞核含有遗传的物质基础。

遗传的物质基础H19世纪末，染色体世纪末，染色体的的发现发现和发现染色体数目在发育中的和发现染色体数目在发育中的变化规律，使孟德尔遗传定律有了物质基础变化规律，使孟德尔遗传定律有了物质基础2、细胞学说改变了胚胎发育和遗传的概念、细胞学说改变了胚胎发育和遗传的概念Developmental Biology3、、Mosaic and Regulative Development 19世纪世纪80年代，年代，Weismann提出了提出了mosaic development学说：合子中的大量特殊因子在细胞分裂中不均等分配，学说：合子中的大量特殊因子在细胞分裂中不均等分配，导致了不同细胞向不同命运的发育导致了不同细胞向不同命运的发育Developmental Biology3、、Mosaic and Regulative Development(续续) 支持嵌合体学说的实验证据：支持嵌合体学说的实验证据：Wilhelm Roux的实验：的实验：Developmental Biology3、、Mosaic and Regulative Development(续续) Wilhelm Roux的同事的同事Hans Driesch的下述实验表明，胚的下述实验表明，胚胎具有在局部被排除或受损伤后仍正常发育的能力，即胎具有在局部被排除或受损伤后仍正常发育的能力，即胚胚胎发育是可调节的胎发育是可调节的。

Developmental Biology4、、Discovery of Induction 1924年，年，Hans Spemann和和Hilde mangold的移植实验表的移植实验表明，明，胚胎的一种组织可以指导另一种相邻组织的发育胚胎的一种组织可以指导另一种相邻组织的发育Developmental Biology5、遗传学、分子生物学与发育生物学的结合、遗传学、分子生物学与发育生物学的结合H1900年，孟德尔遗传定律研究遗传元素在世代间的传递年，孟德尔遗传定律研究遗传元素在世代间的传递H1909年荷兰植物学家年荷兰植物学家Wilhelm Johannsen提出基因型和表现型的提出基因型和表现型的概念，首次使遗传学和胚胎发育学发生关系概念，首次使遗传学和胚胎发育学发生关系H20世纪世纪40年代证明：年代证明：DNA是遗传物质是遗传物质，，控制蛋白质的合成控制蛋白质的合成H20世纪世纪50年代发现：年代发现：DNA为双螺旋结构为双螺旋结构H20世纪世纪60年代：三联体密码被破解年代：三联体密码被破解H20世纪世纪70年代：年代：DNA重组技术出现重组技术出现H20世纪世纪80年代：转基因技术出现。

年代：转基因技术出现H20世纪世纪90年代：动物克隆技术出现年代：动物克隆技术出现H世纪之交：世纪之交：HGPH新的突破：新的突破：stem cells, proteomics, conditional gene knockout, mutagenesisDevelopmental Biology二、发育生物学研究中的主要模式动物 各种模式动物各有优点，其研究成果不仅可以揭示特定物种的特点，还有助于动物发育的一些普遍规律和机制 (一) Invertebrate ModelsDevelopmental Biology 主要优点主要优点1. 体积小，易于繁体积小，易于繁 殖；殖；2. 产卵力强；产卵力强；3. 性成熟短；性成熟短；4. 易于遗传操作：易于遗传操作： 如诱变；如诱变；5. 基因组序列已全基因组序列已全 部测出部测出 (Science, Mar. 24, 2000)120Mb encodes 13,601 proteins)1. Drosophila melanogaster: Insect modelDevelopmental Biology2、、Caenorhabditis elegans: Worm model 主要优点主要优点1. 易于养殖：成虫易于养殖：成虫 体长体长1mm，，易冷易冷 冻保存冻保存；；2. 性成熟短：性成熟短：2.5-3 天，两种成虫；天，两种成虫；3. 细胞数量少，谱细胞数量少，谱 系清楚；系清楚；4. 易于诱变；易于诱变；5. 基因组序列已全部基因组序列已全部测出测出 (Science, Dec. 11, 1998)。

97MB encodes 19,099 proteins.)Developmental Biology(二二)、、Vertebrate ModelsDevelopmental Biology1. Xenopus laevis: Amphibian model 主要优点主要优点1. 性成熟短；性成熟短； 2. 卵体大，易于操卵体大，易于操 作；作；3. 抗感染力强，易抗感染力强，易 于组织移植；于组织移植；Developmental Biology 主要优点主要优点1. 体积小，易于饲体积小，易于饲 养殖；养殖；2. 产卵力强；产卵力强；3. 性成熟短；性成熟短；4. 易于遗传操作：易于遗传操作： 如诱变；如诱变；5. 体外受精和发育，体外受精和发育， 易于观察；易于观察；6. 基因组序列已全基因组序列已全 部测出2. Danio rerio (zebrafish)Developmental Biology3. Mus musculus (Mouse)Developmental Biology4. Gallus gallus (Chicken)Developmental Biology三、发育生物学中的基本概念及规律三、发育生物学中的基本概念及规律•(一)、Five major developmental processes•1. Cell division: • Cleavage: 细胞分裂快、没有细胞生长的间歇期，因而新生细胞的体积比母细胞小。

Developmental Biology•2. Pattern formation: • (1) 躯体轴线的制定Developmental Biology2. Pattern formation: (2) 胚层的形成胚层的形成Developmental Biology•3. Morphogenesis•最突出的形态变化发生在原肠作用开始之后Developmental Biology4. Cell dif-ferentiation: 人类胚胎可最后人类胚胎可最后发育出至少发育出至少250种种不同细胞类型，不同细胞类型，分化通常是不可分化通常是不可逆的Developmental Biology 5. Growth 胚胎在基本的胚胎在基本的pattern形成之后，其体积会形成之后，其体积会显著增长，原因在于显著增长，原因在于细胞数量增加、细胞细胞数量增加、细胞体积增加、胞外物质的积累体积增加、胞外物质的积累不同组织器不同组织器官的生长速度也各异官的生长速度也各异Developmental Biology(二)、Cell Behaviour Cell behavior Gene Embryonic development 细胞行为主要包括：Cell state: 指基因活性状况。

Cell-to-cell signaling: 细胞间信号的传送、接受、反应Cell movement and cell-shape changes:细胞通过形态改变及运 动产生的机械动力，导致特殊结构的形成Cell proliferation: 躯体不同部位的细胞增生速度不一，可导致 整体结构的改变Cell death: 在特定的发育时期，特定部位的细胞的死亡是形成 正确结构所必需的Developmental Biology(三三)、基因控制细胞行为、基因控制细胞行为 是通过控制细胞中的蛋是通过控制细胞中的蛋 白质的产生而实现的白质的产生而实现的•House-keeping proteins:几乎存在于几乎存在于所有类型细胞中，通常用于产生能所有类型细胞中，通常用于产生能量、在代谢途径中生成或降解产物，量、在代谢途径中生成或降解产物，如组蛋白及转录或翻译中所必需的如组蛋白及转录或翻译中所必需的蛋白因子蛋白因子•Tissue-specific proteins: 存在于特殊存在于特殊类型细胞中，从而赋予细胞特定的类型细胞中，从而赋予细胞特定的活性。

如血细胞中的血红蛋白－输活性如血细胞中的血红蛋白－输氧、肌肉细胞合成氧、肌肉细胞合成myosin、、actin、、tropomyosin为收缩提供能量包括为收缩提供能量包括酶、生长因子、受体蛋白、结构分酶、生长因子、受体蛋白、结构分子 细胞可从多个方面来控制蛋白质细胞可从多个方面来控制蛋白质的合成Developmental Biology(四四)、发育是渐进式的、细胞命运决定于不同的发育时间、发育是渐进式的、细胞命运决定于不同的发育时间•Fate of cells:指正常发育情况下细胞将发育的方向，这种方向可因条件的改指正常发育情况下细胞将发育的方向，这种方向可因条件的改变而改变变而改变(see next slide)•Determination:指细胞特性发生了不可逆的改变，发育潜力已经单一化指细胞特性发生了不可逆的改变，发育潜力已经单一化•Specification:指一组细胞在中性环境下离体培养，它们仍按其正常命运图指一组细胞在中性环境下离体培养，它们仍按其正常命运图谱发育Developmental Biology两栖动物眼区细胞的潜能随发育时期的不同而改变两栖动物眼区细胞的潜能随发育时期的不同而改变原肠胚中眼区将发育原肠胚中眼区将发育为眼睛。

为眼睛将原肠胚中眼区细胞移将原肠胚中眼区细胞移植到神经胚的躯干区，植到神经胚的躯干区，它们将按新部位的命运它们将按新部位的命运发育为体节和脊索发育为体节和脊索将神经胚中眼区细胞移将神经胚中眼区细胞移植到神经胚的躯干区，植到神经胚的躯干区，它们仍将发育为类似于它们仍将发育为类似于眼的结构眼的结构胚胎发育早期，细胞的发育潜力更大！胚胎发育早期，细胞的发育潜力更大！Developmental Biology(五五)、诱导作用可使细胞互为不同、诱导作用可使细胞互为不同扩散性信号分子扩散性信号分子跨膜蛋白的直接互作跨膜蛋白的直接互作间隙连接间隙连接(gap junction)信号传导特点信号传导特点H传递距离有限传递距离有限H并非所有细胞都能对某种信号并非所有细胞都能对某种信号发生反应发生反应H不同类型细胞可对同一信号发不同类型细胞可对同一信号发生不同反应生不同反应,e.g., 乙酰胆碱使乙酰胆碱使心肌收缩频率下降，但促使唾心肌收缩频率下降，但促使唾液腺分泌唾液液腺分泌唾液 Autonomous cell fatenon-autonomous cell fateDevelopmental Biology(六六)、、Patterning常涉及常涉及positional information的翻译的翻译Developmental Biology(六六)、、Patterning常涉及常涉及positional information的翻译的翻译(续续)Developmental Biology(七七)、间距模式、间距模式(spacing patterns)可通过侧向抑制作用产生可通过侧向抑制作用产生Developmental Biology(八八)、胞质决定成分的区域化及细胞的不对、胞质决定成分的区域化及细胞的不对称称 分裂使细胞具有不同的特性分裂使细胞具有不同的特性Developmental Biology线虫的不对称卵裂产生不同命运的卵裂球线虫的不对称卵裂产生不同命运的卵裂球Developmental Biology二、传统的发育生物学研究技术二、传统的发育生物学研究技术Developmental Biology染料细胞标记染料细胞标记Developmental Biology荧光细胞标记荧光细胞标记Developmental Biology细细 胞胞 移移 植植Developmental Biology三、控制发育的基因的鉴定三、控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法及其表达和功能检测方法Developmental Biology基因组时代：人类基因组计划基因组时代：人类基因组计划Developmental BiologyDevelopmental BiologyDNA序列已经告诉了我们什么序列已经告诉了我们什么？？Developmental Biology后基因组时代＝功能基因组时代后基因组时代＝功能基因组时代空间结构？空间结构？胞内分布及靶位？胞内分布及靶位？影响器官？影响器官？基因类型？基因类型？底物？底物？影响途径？影响途径？Developmental Biology(一一)、鉴定发育相关新基因的主要方法、鉴定发育相关新基因的主要方法—从自然或人工突变体中分离鉴定控制发从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；育的基因；—分离时空特异性表达基因的方法；分离时空特异性表达基因的方法；—利用基因序列同源性的克隆法；利用基因序列同源性的克隆法；—利用生物大分子间的相互作用克隆新的利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。

基因Developmental Biology(一一)、鉴定发育相关新基因的主要方法、鉴定发育相关新基因的主要方法—从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；因；—分离时空特异性表达基因的方法；分离时空特异性表达基因的方法；—利用基因序列同源性的克隆法；利用基因序列同源性的克隆法；—利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因Developmental Biology从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因—隐性突变；隐性突变；—半显性突变半显性突变；；—显性突变显性突变突变体的类型突变体的类型Developmental Biology从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因突变类型图示突变类型图示Developmental Biology从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因—自然群体中的突变体；自然群体中的突变体；—化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚硝基脲化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)；；—外源外源DNA插入法，如插入法，如DNA注射、病毒感染、转座子注射、病毒感染、转座子利用等；利用等；—X－－射线或射线或 r－－射线照射射线照射获得突变体的方法获得突变体的方法Developmental Biology斑马鱼上斑马鱼上ENU化学突变研究的成就化学突变研究的成就(1996)从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因化学诱变法化学诱变法Developmental Biology从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因隐性突变体的鉴定方法隐性突变体的鉴定方法化学诱变法化学诱变法Developmental Biology从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因DNA插入诱变法插入诱变法Developmental Biology反转录病毒插入引起的突变的鉴定反转录病毒插入引起的突变的鉴定从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因DNA插入诱变法插入诱变法Developmental BiologyExpression of GFP in virus-infected fishTransientgermline从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因DNA插入诱变法插入诱变法Developmental BiologyAn example of mutational phenotypes从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因DNA插入诱变法插入诱变法Developmental Biology从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因—Genetic mapping and chromosomal walking；；—PCR or Southern hybridization；；—Candidate cloning；；—Differential display/subtractive cloning从突变体克隆基因的方法从突变体克隆基因的方法Developmental Biology(一一)、鉴定发育相关新基因的主要方法、鉴定发育相关新基因的主要方法—从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；因；—分离时空特异性表达基因的方法；分离时空特异性表达基因的方法；—利用基因序列同源性的克隆法；利用基因序列同源性的克隆法；—利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。

利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因Developmental Biology分离时空特异性表达基因的方法—获取特定组织：直接取材或转基因法取材；获取特定组织：直接取材或转基因法取材；—构建构建cDNA文库文库；；—从蛋白质到基因从蛋白质到基因；；—Differentiatial hybridization/differential display/subtractive cloningDevelopmental Biology分离时空特异性表达基因的方法•基因芯片/核酸杂交法Developmental BiologySubtractive cloning分离时空特异性表达基因的方法Developmental Biology利用基因序列同源性的克隆法—用一个物种的基因直接做探针分离另一个物种的同源基因；—根据多个物种的蛋白序列分离另一个物种的同源基因；—根据同一基因家族的不同成员间的保守序列分离新的家族成员；Developmental Biology利用大分子间的相互作用克隆新的基因—鉴定可与蛋白质结合的鉴定可与蛋白质结合的DNA序列序列—分离靶蛋白质，（可采用分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay)—克隆靶蛋白的表达基因。

克隆靶蛋白的表达基因利用利用DNA与蛋白质间的相互作用与蛋白质间的相互作用Developmental Biology分离时空特异性表达基因的方法利用蛋白质之间的相互作用利用蛋白质之间的相互作用酵酵母母双双杂杂交交法法Developmental Biology(二二)、基因表达的检测、基因表达的检测—mRNA的检测的检测—蛋白质的检测蛋白质的检测—启动子活性检测启动子活性检测Developmental Biology(二二)、基因表达的检测、基因表达的检测—mRNA的检测的检测—蛋白质的检测蛋白质的检测—启动子活性检测启动子活性检测Developmental BiologymRNA的检测—Northern blot—Dot blot—RT-PCR—DNA Microarray—in situ hybridizationDevelopmental BiologyNorthern杂交的杂交的作用：作用：检测基因检测基因的转录物的存在的转录物的存在及是否发生了选及是否发生了选择性拼接择性拼接Developmental BiologymRNA的检测原位杂交原位杂交(in situ hybridization)Developmental Biology利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱mRNA的检测Developmental Biology(二二)、基因表达的检测、基因表达的检测—mRNA的检测的检测—蛋白质的检测蛋白质的检测—启动子活性检测启动子活性检测Developmental Biology蛋白质的检测—电泳法电泳法—Western blot—抗体染色法抗体染色法Developmental Biology(二二)、基因表达的检测、基因表达的检测—mRNA的检测的检测—蛋白质的检测蛋白质的检测—启动子活性检测启动子活性检测Developmental Biology启动子活性检测法表达载体的构建：Developmental Biology(三三)、基因对发育的影响的功能性研究、基因对发育的影响的功能性研究—基因敲除法基因敲除法(gene knockout)—异位表达法异位表达法(ectopic expression)—Rescue—Antisense RNA—Antisense oligos—DsRNA interference (RNAi)—Antibody blocking—Dominant negative receptor mutations—Dominant interferring alleleDevelopmental Biology用基因敲除法研究基因的功能用基因敲除法研究基因的功能Developmental Biology三、基因对发育的影响的功能性研究三、基因对发育的影响的功能性研究—基因敲除法基因敲除法(gene knockout)—异位表达法异位表达法(ectopic expression)—Rescue—Antisense RNA—Antisense oligos—DsRNA interference (RNAi)—Antibody blocking—Dominant negative receptor mutations—Dominant interferring alleleDevelopmental Biology转转基基因因动动物物与与基基因因的的异异位位表表达达•D DN NA A注注射射；；•R RN NA A注注射射；；•病病毒毒感感染染。

Developmental Biology用组织特异性启动子控制外源基因的表达用组织特异性启动子控制外源基因的表达绿色血液绿色血液绿色神经细胞绿色神经细胞Developmental Biology(三三)、基因对发育的影响的功能性研究、基因对发育的影响的功能性研究—基因敲除法基因敲除法(gene knockout)—异位表达法异位表达法(ectopic expression)—Rescue—Antisense RNA—Antisense oligos—DsRNA interference (RNAi)—Antibody blocking—Dominant negative receptor mutations—Dominant interferring alleleDevelopmental Biology(三三)、基因对发育的影响的功能性研究、基因对发育的影响的功能性研究—基因敲除法基因敲除法(gene knockout)—异位表达法异位表达法(ectopic expression)—Rescue—Antisense RNA—Antisense oligos—DsRNA interference (RNAi)—Antibody blocking—Dominant negative receptor mutations—Dominant interferring alleleDevelopmental BiologyDominant Negative Receptor Mutations 细胞膜细胞膜 受体胞外区受体胞外区 受体跨膜区受体跨膜区 突变突变 受体胞内区缺失导致受体胞内区缺失导致信号传导的中断信号传导的中断受体胞内区受体胞内区 配体配体配体配体 下游信号分子下游信号分子Developmental BiologyDominant Interferring allele。