福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版.docx

福林（Folin）-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、 原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使 酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）蓝 色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定二、 实验仪器分光光度计试管移液管,容量瓶，分析天平，烧杯三、 实验试剂1・Folin酚试剂甲：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4・5H2O晶体0・5g,溶于1%酒石酸钾100ml 临用时按甲:乙=50： 1混合使用2・Folin酚试剂乙:将10g钨酸钠、2・5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接 上磨口冷凝管，回馏1小时，再加入硫酸锂15g,蒸馏水5ml及液溴 数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴冷却，稀释至 100ml,过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中临用时，用1mol/l的 氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸标准蛋白质溶液：称取1g牛（人）血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1•标准曲线的绘制取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

0123456标准蛋白质溶液(ml)0.00.10.2030.4050.6蒸馆水(ml)1.00.90.80.70.60.50.4Foliu酚试剂甲(ini)5555555各管加入ImlFolin酚试剂乙后，立即摇匀，放置15分钟后比色，在 500nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以吸光度为纵坐标， 标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线2•样品测定准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂,测出光密度值 后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度管号 试剂 、、、12样液(ml)1.01.0Folin-酚试剂甲 (ml)5.05.0室温放置10分钟后，再各加1毫升Folin酚试剂乙，立即摇匀, 放置15分钟，在500nm处测定光密度值五、实验结果标准曲线的绘制:蛋白质浓度 0.00 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10吸光度 0.000 0.079 0.215 0.264 0.346 0.450 0.493吸光度y = 5. 5072x R"2 = 0. 9143•吸光度-线性（吸光度）则根据y=5・5072x=0・325得x为0.05901,则样液的浓度为0・5901mg/ml・六、实验结果分析及思考1、试说明Folin-酚法的优缺点该方法较双缩脲法反应灵敏，与0・1mg/m I浓度的蛋白质样品亦可得 到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。

2、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂， 即Folin—酚B试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏 度Folin—酚试剂由A试剂和B试剂组成A试剂由碳酸钠，氢氧化钠, 硫酸铜及酒石酸钾钠组成蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物B试剂是由磷钼酸和磷钨 酸、硫酸、溴等组成此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的 酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比由此可见是它们的显色灵敏度不同造成的3、Folin酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀?第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作 用生成络合物；第二步是基于Folin试剂（磷钼酸和磷钨酸试剂）在碱 性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物（呈 蓝色反应），因此需要快速混匀，继续实验。