实验二 叶绿素的提取与分离.docx

实验二 叶绿素的提取和分离一、 实验目的从富含叶绿素的菠菜叶片中提取叶绿素，并在薄层层析板上点样使叶绿素 显示不同颜色二、 实验原理 要求同学们先查询资料，了解叶绿素相关知识，实验课上老师讲解三、 实验材料、器具研钵、托盘天平、分液漏斗、干燥锥形瓶、毛细管、薄层层析板、饱和NaCl溶 液、无水Na SO24四、 实验步骤1、叶绿素的提取在中放入几片（约5g）菠菜叶（新鲜的或冷冻的都可以.如果是冷冻的，解冻 后包在纸中轻压吸左水分）加入10mL2:l石油醚和丙酮混合液，适当研磨将 提取液用滴管转移至分液漏斗中，加入 10mL 饱和 NaCl 溶液（防止生成乳浊液） 除去水溶性物质，分去HO层，再用蒸馏水洗涤两次将有机层转入干燥的小锥2形瓶中，加2g无水Na SO，通风处理处理后的液体倾至另一锥形瓶中（如溶液24颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩）2、点样用一根内径 1mm 的毛细管，吸取适量提取液，轻轻地点在距薄板一端 1cm 处，平行点两点，两点相距1cm左右若一次点样不够，可待样品溶剂挥发后.再 在原处点第二次，但点样斑点直径不得越过 2mm3、展开先在小烧杯中放入展开剂［用石油醚和丙酮按 3：1 的比例进行混合作为展开 剂，再将薄层板斜靠于层析缸内壁。

点样端接触展开剂但样点不能浸没于展开剂 中，密闭层析缸待展开剂上升到距薄层板另一端约 1cm 时，取出平放，用铅 笔或小针划前沿线位置，在空气中晾干或用电吹风吹干薄层毛细管点样 薄层色谱展开4、观察层析板并记录实验结果薄层层析时Rf值表示的是原点到层析斑点中心的距离与原点的到展层溶剂的前 沿距离包括扩散最快的是什么，扩散最慢的是什么 最宽的色素带是什么，最窄的色素带是什么 哪两个色素带距离相距最远，哪两个最近等等 各种色素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散的快，反 之则慢最快：胡萝卜素 次之：叶黄素 次之：叶绿素A最慢：叶绿素 B颜色分别为：橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色，最宽的是叶绿素 A最窄的是胡萝卜素胡萝卜素和叶绿素 B 最远 叶绿素 A 和叶绿素 B 最近 实验十四、 植物色素的提取和薄层色谱分析 一、 实验目的：1、了解薄层色谱的基本原理和应用2、掌握薄层色谱的操作技术二、实验原理：1、原理薄层色谱仃hin Layer Chromatography）常用TLC表示，又称薄层层析，属 于固－液吸附色谱样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之 间进行分离。

由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进 行不同程度的解吸，从而达到分离的目的2、 薄层色谱的用途：1）化合物的定性检验通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定） 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距 离，称比移值（Rf值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两 种性质相似的化合物是否为同一物质但影响比移值的因素很多，如薄层的厚 度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、 挥发性等所以，要获得重现的比移值就比较困难为此，在测定某一试样时， 最好用已知样品进行对照距离 溶剂前沿至原点中心的点中心的距离 溶质最高浓度中心至原2） 快速分离少量物质几到几十微克，甚至O.OIpg）3） 跟踪反应进程在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消 失，来判断反应是否完成4） 化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质 此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱 分析的物质3、 色谱法 色谱法是与植物天然色素的分离提取同时发展起来的.色谱法（纸色谱,薄层 色谱和柱色谱）至今仍然是分离叶绿素等天然色素最有效的方法。

色谱法分离叶绿体色素的基本原理是利用不同色素在各种有机溶剂中的分配系数,或在吸附剂上的吸附能力的不同,当它们通过色谱柱/床时,这种分配或 吸附过程反复多次地进行,最后将它们一一分离开来通常认为,纸色谱属于分配色谱.它是以滤纸为惰性支持物,滤纸纤维一般能 吸收约20 % 的水分,其中有6~7 % 以氢键形式与纤维素上的羟基结合,构成纸 色谱的固定相.在展开过程中,被分离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配, 龙岩学院 分析化学精品课程 分析化学实验项目指导书 2 达到相互分离.薄层色谱和柱色谱的吸附剂（固定相）有硅胶,氧化铝,硅藻土等无 机物，也有糖类，纤维素,聚酰胺,C18和离子交换树脂等有机物■它们的分离机理 也各不相同,如吸附,分配,氢键,正相和反相色谱等对于纸色谱或薄层色谱,毛细 管作用是推动溶剂展开的动力.被分离物质在图谱上的位置,可用比移值 Rf 表示 只彳=原点至斑点中心的距离/原点至展开剂前沿的距离植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源.在 把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用.高等植物 体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a,叶绿素b,0 胡萝卜素和叶黄素四种.叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合 作 用中吸收可见光,并将光能转变为化学能.叶绿素是植物进行光合作用所必需 的催化剂■在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素 b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基 被 叶绿素b中的甲酰基所取代。

三 、实验装置四、实验操作步骤和内容：(一)步骤1、 吸附剂的选择 薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶1)、硅胶：“硅胶H”一不含粘合剂；“硅胶G” 一含煅石膏粘合剂； 其颗粒大小一般为260目以上颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果 不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想 化合物的吸附能力与它们的极性成正比， 具有较大极性的化合物吸附较强， 因而 Rf 值较小酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 > 烯 > 饱和烃本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶G龙岩学院 分析化学精品课程 分析化学实验项目指导书 32、 薄层板的制备(湿板的制备) 薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果薄层应尽量均匀且厚度要固定否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复在烧杯中放入2g硅胶G,加 入5—6ml 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状将配制好的浆料倾注到 清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温 下晾干后进行活化本实验用此法制备薄层板4片3、 薄层板的活化 将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据 需要而定。

硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105—110°C活化30min氧化 铝板在200C烘4h可得到活性为II级的薄板，在150—160C烘4h可得活性 为III—W级的薄板活化后的薄层板放在干燥器内保存待用4、 点样先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管 吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm若因样品溶液太 稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大， 造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果若在同一板上点几个样，样点间距 离应为 1点样要轻，不可刺破薄层5、展开 薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行为使溶剂蒸气迅速达到平衡， 可在展开槽内衬一滤纸在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过 1cm将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中盖 好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿 位置晾干，观察斑点位置，计算 Rf 值分离叶绿体色素的展开剂有:石油醚(60 ~ 90°C)-丙酮-乙醚(3:1:1);石油醚-丙酮(8:2);石油醚-乙酸乙酯(6:4);苯-丙酮(7:3)和石油醚(30 ~ 60C)-丙酮-正丁醇 (90:10:4.5)等.本实验将150 mL石油醚(60 ~ 90C)-丙酮-乙醚(3:1:1)展开剂倒入层析缸中，并 在层析缸的内壁四周贴一张5 cm高的滤纸，滤纸下部浸在展开剂中,盖好盖子平衡 10~15 min■将点好样的硅胶板放入展开缸里，液面不能超过点样线，盖好盖子进 行上行层析■待展开剂前沿上升到距硅胶板上端1・5~2 cm时，取出硅胶板置于通 风橱里晾干，可看到层析板上出现若干色素带，其排列顺序一般是0 -胡萝卜素, 去 镁叶绿素,叶绿素a,叶绿素b和叶黄素等多条色带■用铅笔标记出样品斑点, 计算各色素的比移值 Rf.6、 显色 被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。

如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色还可使用腐蚀性的显 色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧 龙岩学院 分析化学精品课程 分析化学实验项目指导书 4 光背景上呈暗色斑点本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察7、 样品收集将层析板上分开的0 -胡萝卜素,叶绿素a,叶绿素b的色带分别用干净的刮刀刮入 试管中，加入5 mL丙酮提取，低温避光保存.8*、温度对薄层色谱分离的影响取两块1X5 cm 2的商品硅胶板，点样后，以相同的展开剂,分别置于冰箱(4C) 和室温(20C以上)展开■观察和对比它们的分离结果. (二)实验内容：(以下实验内容选做其一)1、 检验甲基橙的纯度通过与已知标准物对比的方法检验物质是否纯净) 实验样品：甲基橙粗品(自制)、甲基橙纯品溶剂：乙醇：水=1：1 展开剂：丁醇：乙醇：水=10：1：12、 混合物的分离 实验样品：圆珠笔芯油 溶剂：95%乙醇 展开剂：丁醇：乙醇：水=9：3：1(体积比)3、 1%偶氮苯、1%间硝基苯胺、荧光黄(95%乙醇，1mg/1ml)、次甲基蓝、环己 烷:乙酸 9:14、 植物色素0 -胡萝卜素,去镁叶绿素,叶绿素a,叶绿素b和叶黄素的提取与分 离。

五、实验关键步骤：1、载玻片应干净且不被手污染，吸附剂在玻片上应均匀平整2、 点样不能戳破薄层板面，各样点间距1—1.5cm,样点直径应不超过2mm3、 展开时，不要让展开剂前沿上升至底线否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置六、思考题1、 如何利用 Rf 值来鉴定化合物？ 答：在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离， 称比移值（Rf值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性 质相似的化合物是否为同一物质但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度， 吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发 性等所以，要获得重现的比移值就比较困难为此，在测定某一试样时，最 好用已知样品进行对照2、 薄层色谱法点样应注意些什么？答： （1）先用铅笔在距薄层板一端 1cm 处轻轻划一横线作为起始线，然后用 毛细管吸取样品，在起始线上小心的点样，斑点直径一般不超过2mm2） 若因样品溶液太稀，可以重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重 新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。

3） 若在同一板上点几个样，样点间距离应为 1-1.5cm 4）点样要轻，不可刺破薄层3、 常用的薄层色谱的显色剂是什么？ 答：显色凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱薄层色谱还可使用腐蚀 性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓。