第六章多底物酶促反应动力学.ppt
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多底物酶促反应动力学多底物酶促反应动力学 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 国际酶学委员会把酶六大类反应对应于底物的分类如下： 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 底物数酶分类作用类型占酶总数%1单底物异构酶A=B52单向单底物裂合酶A=B+C123假单底物水解酶A-B+H2O=A-OH+BH264双底物氧化还原酶AH2+B=A+BH227A2+B3+=A3+B2+基团转移 A+BX=AX+B245三底物连接酶A+B+ATP=AB+ADP+Pi6A+B+ATP=AB+AMP+Ppi6.1 酶促反应按底物数的分类单底物反应动力学指1,3,2的正向反应(约40%)其余多底物反应多为多底物反应(约60%) 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 6.2 多底物反应基本命名法1963年由Cleland建议建立的1)按底物和酶结合次序为A、B、C表示2)按产物在酶上释放次序为P、Q、R表示3)稳态物（包括酶）以E、F、G表示非中心复合物：指酶活性中心没有全部被底物占居ENAD+ENADHEAEP中心复合物中心复合物：指酶活性中心全部被底物占居命名：（EAB-EPQ）E:稳态酶，EAB和EPQ:中心过渡态中间物 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 1)有序顺序反应：xxxxxxx-底物、产物规定：反应历程OOOOOOO-酶存在形式 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 EAB只能来自EA，而不是EB，A是一个领先底物（第一底物），B是随后底物（第二底物）有其顺序性。
6.3 多底物酶促反应的表示方法、命名和举例 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 2.异形有序反应：酶的形式有改变，其速度方程不同于上述的速度方程A BPQEEA(EAB-FPQ)FQF还有其酶促反应，中心过渡态络合物形成很慢，而分解速度很快被称为TheorellChance反应：即形成中间物的速度极慢而分解速度极快ABPQEEAEQE 例子：NAD+乙醇乙醛NADHEE-NAD+E-NADHEE：为马肝醇脱氢酶第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学为什么有顺序性？被认为酶上与第二底物结合位点原先在酶结构内部(中间)，第二底物无法与之结合由于第一底物结合改变了酶原有结构，暴露了酶结构上第二底物结合位点，使酶上第二个结合位点能够顺利地与B结合A,B的结合是在酶的不同位点上 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 2.随机顺序反应（Randan BiBi）： 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 AABABEAB-EPQPPEEE-AE-BE-QE-P例子A 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学3.乒乓机制：特点：1不形成三元络合物，底物不同时与酶结合。
2在全部底物与酶结合前，已经有一种放出来由于底物、产物一进一出，所以像打乒乓一样，叫乒乓机制APBQE(EAEP)F(EB-EQ) E谷丙转氨酶的作用：谷氨酸-酮戊二酸丙酮酸丙氨酸E(E-谷氨酸-F-酮戊二酸)F(F-丙酮酸-F-丙氨酸)E 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 7.4 多底物动力学机制判别：因为是双底物反应，所以需要加以判别多底物动力学机制属哪类机制，用三种方法1)1)底物动力学方法2)2)产物抑制动力学方法3 3）同位素交换方法底物动力学方法：有序顺序机制推导法是用图象法推出在稳态条件下推出的双底物反应速度公式：VABV=KmBA+KmAB+KiaKiaKmB+AB是底物A与酶E结合的解离常数 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 解释公式中几个常数：多底物反应中，一底物的米氏常数可随着另一底物浓度变化而变化KmAB：指底物B浓度达饱和，底物A的米氏常数在底物B低于饱和浓度时，测得随底物B而变化的A的各个Km，称为表观米氏常数KmKmBA:指底物A浓度达饱和，底物B的米氏常数在底物A低于饱和浓度时，测得随底物A而变化的B的各个Km，称为表观米氏常数Km 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 1KmBAKmABKiaKmBAB=+vVmABVmABVmABVmAB 1 KmB KmA Kia KmB 1 = + + + v VmB VmA VmAB Vm1KmA11当B=,=+VVmAVm1KmB11当A=,=+VVmBVm 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 具体实验方法：以A、B双底物反应作为例子，可将底物B固定在几个不同浓度下。
固定在某一B浓度时，测不同A浓度对反应速度影响；也可固定A在某一浓度，测定不同B浓度对反应速度影响，再分别作双倒数图 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 Lineweaver-Burk双倒数作图：当固定几个不同的B浓度或者几个不同的A浓度时，作1/A-1/v和1/B-1/v的关系图，得到如下图 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 直线的交点在坐标的左侧，这是顺序机制的特点且交点可在横坐标的的上方、下方或者线上 1. 1. 在横坐标上面横坐标上面，表明固定底物B或A与酶结合不影响可变底物A或B的Km，即B或A浓度大小互不影响各自的Km,说明表观Kmapp=Km,KmA=Kia,KmB=Kib 2. 2. 在横坐标下方横坐标下方，表明可变底物A的表观Km随B的增加而增加，KmAKia，KmBKib 3. 3. 在横坐标上方横坐标上方，表明可变底物A的表观Km随着B的增加而减少，KmA表明可变底物A的表观Km随着B增加而增加，KmAKia,KmBKib 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 且交点在1/A上截距可计算出来设有两个固定浓度B1,B2,有两个相应的1/v1,1/v2,而且在交点处的截距相等 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 1KmBKmAKiaKmB1=+vVmBVmAVmABVm11KmAKiaKmBKmB=(+1+)v1VmAAB1B111KmAKiaKmBKmB=(+1+)v2VmAAB2B21/v1=1/v2Kia/AB1+1/B1)=(Kia/AB2+1/B2)Kia/A(1/B1-1/B2)=(1/B1-1/B2)1/A=-1/Kia 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学1/A = 1/Kia斜率, 截距都可用此法取得。
问题问题：从作图看出，从直线方程取得的是复合未知数，要用二次作图法求出KmA，KmB，Vm斜率斜率=KsAKmB/Vm截距=KmA/Vm截距=KmA/KmBKsA 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 1/V的截距斜率=KmB/Vm截距=1/KmB截距=1/Vm上面的方法只能判别顺序机制中的有序和快速平衡的随机机制，但是无法区无法区分有序和随机机制分有序和随机机制，只能通过其他方法来判别 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 乒乓机制速度方程和动力学常数：求解动力学方程用KingAltman图象法推出通过平衡学说推出的方程：经过双倒数后，1KmABKmBAAB=+vVmABVmABVmAB1KmAKmB1=+vVmAVmBVm 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 1KmA11KmB=+(1+)y=ax+bvVmAVmB当A无穷大时变成单底物反应的米氏方程上式一项可去除，与A无关，为单底物米氏方程为y=ax+b的直线方法,其双倒数方程：1 KmB 1 1 当A=, = + V Vm B Vm当B无穷大时变成单底物反应的米氏方程。
上式一项可去除，与B无关，为单底物米氏方程 1 KmA 1 1 当B=, = + V Vm A Vm 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 乒乓机制动力学双倒数作图： 用上述双倒数作图法，如能获得下图的两组平行线，即乒乓机制的特征 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 但有时当直线延长相当距离会出现相交而不能确定是否乒乓机制，也可能是顺序机制如测定逆向反应的动力学也同样获得两组平行线，或证实其半反应中有同位素交换即可获得进一步确定双倒数作图法产生的复合函数，为两个未知数，只能通过二次作图，求KmA,KmB,Vm 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 上述方法适用：顺序机制中有序机制及快速平衡的随机机制，但不能区别顺序机制还是随机机制需要进一步使用其他方法才能把它们区别开来 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 产物抑制动力学方法是其中之一产物抑制动力学方法是其中之一产物抑制：是鉴别多底物反应属有序、随机还是乒乓机制起重要作用。
特点：方法简便特点：方法简便A+B=P+Q，采用几个P浓度或不加P，测每个P浓度或不加P时不同A（固定B）及不同B（固定A）对反应速度的影响，再以Q代替P，重复以上实验最后以实验结果作双倒数图，不同P时，1/A对1/v或1/B对1/v，及不同Q时，1/A对1/v或1/B对1/v作图看看P P、的抑制方式是竞争性还是非竞争性和的抑制方式是竞争性还是非竞争性和反竞争性，然后综合分析来判别反竞争性，然后综合分析来判别 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 Cleland分析大量动力学数据，总结两条重两条重要规则要规则：1. 浓度变化的底物和一种形式的酶结合，抑制性产物和另一种形式的酶结合双倒数作图,只有纵坐标截距变化纵坐标截距变化2.a)浓度变化的底物和抑制性产物都结合在同一个酶上双倒数作图则产生斜率则产生斜率变化b)浓度变化的底物所结合的酶形式和抑制性产物结合的酶形式间可在酶的反应历程中通过可逆变化而互相联接双倒数作图产生斜率变化产生斜率变化 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 Cleland分析大量动力学数据，总结两条重要规则两条重要规则：应用Cleland方法方法的关键：看产物是否抑制和抑制方式，取决于抑制性产物是P或Q中的哪一个？如浓度变化的底物是那一个，A或B？同样，与另一个固定浓度的底物是否饱和有关。
实验结果与判断结果一致全部结果列表于下 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 判别乒乓机制问题：APBQE(EAEP)F(EB-EQ)EGlu-酮戊二酸丙酮酸AlaE(E-Glu-F-酮戊二酸)F(F-丙酮酸-F-Ala)E 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 Cleland判断有序和随机机制， 其反应历程如下： 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 规律总结如下：1 A固定底物，B变化底物，p=0, Q=常数2 A固定底物，B变化底物，p=常数, Q=01 B固定底物，A变化底物，p=0, Q=常数2 B固定底物, A变化底物，p=常数, Q=0 第六章第六章 多底物多底物 酶促反应动力学酶促反应动力学 3.同位素交换法下面简单阐述同位素交换法在研究多底物动力学上的应用先举一个例子：蔗糖磷酸化酶葡萄糖-1-P+果糖=蔗糖+H3PO4这个反应是可逆反应在没有果糖时，G-1-P可以与32P标记的KH232PO4发生交换，表明有下面的反应：Suc磷酸化酶G-1-P+32Pi=G-1-32P+Pi研究认为，这种现象是蔗糖磷酸化酶的乒乓机制造成,转移葡萄糖基。
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