流式细胞术分选小鼠肺泡巨噬细胞及鉴定.docx

流式细胞术分选小鼠肺泡巨噬细胞及鉴定韩鑫涛;赵殿元;唐丽【摘要】目的建立一种基于流式细胞术分离小鼠肺泡巨噬细胞(AM)的方法•方法 小鼠肺脏在体外经胶原酶IVV消化后获得单细胞悬液，再经CD11b和CD11c抗体 标记，利用流式细胞仪分选获得CD11blowCD11c+ AM,并经台盼蓝染色计数细胞 活力，以及通过Real-time PCR和吞噬功能进行鉴定•结果流式细胞术分选小鼠月市 脏单细胞悬液，获得CD11blowCD11c+细胞純度为(93±2)%,细胞活力为 (80±5)%;Real-time PCR结果显示过氧化物酶体增殖物激活受体y(PPARy )在该 群细胞高表达(P v 0.001)；细胞吞噬功能实验结果显示该群细胞具有较好的吞噬活 性，吞噬率约为10%.结论建立了一种基于流式细胞术分选获得AM的方法，该方法 获得的细胞纯度高，细胞活性好，可用于功能性实验.％Objective To establish a method for isolating alveolar macrophage (AM) of mouse based on flow cy tometry.Methods The lungs were digested by collagen VV in vitro to prepare single-cell suspension that was stained by CD11 b and CD1 1 c antibody.CD1 1 b1owCD1 1 c + cell population were AM and isolated by flow cytometry.After that,the cell viability was measured via the Typan blue staining,and the identification of AM was through flow cytometry and realtime PCR.Results CD1 1 b1owCD1 1 c + cell population was isolated by flow cytometry,the purity was (93 ± 2)% and the cell viability was (80 ±5)%.The real-time PCR results showed that peroxisome proliferator- activated receptor y (PPARy) mRNA was highly expressed in AM isolated by flow cytometry (Pv 0.001).In addition,the functional assay showed that the isolated AM possess high phagocytic activity.Thus,the results describeds如疵-K眨凶遐w【w绘】(009叩 96Hd)Ks【laalw】■noCNso)口 oz【s■(狒毎】奁專辛i秋》【畫i•S1U①uu 一」①dx① -euolounj」04 p ① sn ① q cs Lpz/W Al->t;e -00 poo6 pue >1匸 nd -00-C6Zse-c po-c一① uu ①-C1.P ①_cs=qels ① se/v\ 巴一 ① UU01AO /v\0-4 uo p ① seq 乏 < 6UC一 elqo」O4 po-cl ① uu < uosnpuou・IAI< ①」① zv\ S--① 0 p ① leos 一 ①£ le-cl ① IglsuoLU ① p ① >oqe味期a®启芒0gIAIVW・爪因略®(AH

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该文采用流式细胞术分选小鼠 CD11blowCD11c+的AM，并对细胞纯度、PPARy转录因子及细胞吞噬活性进 行检测，为进一步体外功能性试验的研究提供细胞纯度高、细胞活性好的AM1.1实验动物SPF级C57BL/6小鼠，6~8周龄，体质量20~22 g,雄性，购自 北京维通利华实验动物技术有限公司，并饲养于无菌的独立通气笼中动物实验室 内相对湿度40% - 70%，温度约为25 °C,每日光照12 h，自由摄食饮水1.2主要试剂胶原酶IV（美国Sigma Aldrich公司）；RPMI-1640（美国Hyclone 公司）；DNase 1（瑞士 Roche 公司）；CD11b-APC 或 CD11b PE-Cy7 抗体、 CD11c-PE 抗体、CFSE-FITC 荧光染料（美国 eBioscience 公司）；Carboxyl Fluorescent Sky Blue Particles（美国 Spherotech 公司）；RNA 小提试剂盒（德国 Qiagen公司）；cDNA反转录试剂盒（日本Takara公司）；SYBR green（日本东洋 纺公司）；其他试剂均为国产分析纯1.3 小鼠肺脏单细胞悬液的制备戊巴比妥钠腹腔麻醉, 75%乙醇浸泡,置于超净 台，固定在解剖盘中；剪开颈部皮肤，打开胸腔，用1 ml无菌注射器吸取1 ml PBS注入心脏，重复3次，冲洗干净肺循环中的血液，小心去除胸腺及胸部淋巴 结，摘全肺于4 C含5%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的RPMI-1640培养 基中；眼科剪刀剪碎，转移至15 ml离心管，1 500 r/min离心5 min，弃上清液， 加入 10 ml 消化液（0.5 mg/ml 胶原酶 IV, 0.02 mg/ml DNase I），置于 37 C水 浴锅中孵育30 min ,每5 min摇晃1次；吹散组织，另加5 ml消化液，延长消 化15 min ；将细胞混合物连续通过注射器，打散组织块，过70 pm细胞筛网， 得到单细胞悬液；1 500 r/min离心5 min，加无Ca2+、Mg2+、含10 mmol/L 乙二胺四乙酸的PBS重悬，室温摇5 min;1 500 r/min离心5 min，弃上清液， 加5 ml红细胞裂解液冰上裂解10 min，加5 ml含10% FBS的RPMI-1640终 止裂解，4 °C、1 200 r/min离心10 min，收集细胞。

1.4流式抗体标记及流式细胞仪分选文献［3, 10］中通常将CD11blowCD11c+细胞 群定义为AM，所以本实验中选用CD11b和CD11c抗体标记肺脏单细胞悬液 细胞计数后用流式缓冲液(RPMI-1640+1% FBS)重悬，一般1x107个细胞用300 pl缓冲液重悬；加入3 pl FC封闭抗体，室温孵育15 min ；将细胞悬液分为两管， 1号管为阴性对照，2号管加入3 pl CD11b-APC(或CD11b PE-Cy7)抗体和3 pl CD11c-PE抗体作为实验组，避光、4 C标记20 min，然后用流式缓冲液洗2遍， 再用2.5 ml 流式缓冲液重悬并移入流式管中，进行流式细胞分选本实验使用的 流式细胞仪为BD FACSAria III，调试参数后，设定分选条件进行分选1.5细胞计数及细胞活力检测流式细胞分选后，将收集的细胞悬液在4 C条件下1 500 r/min离心5 min，弃上清液，并用适量含10% FBS的RPMI-1640重悬 取细胞悬液100 pl于新的1.5 ml离心管中，并加入等量的0.4%台盼蓝染液，混 匀，然后取10 pl加入细胞计数板，用细胞计数仪(美国Biorad公司)计数并读取 细胞活力。

细胞活力=活细胞数/总细胞数1.6 Real-time PCR检测PPARy在AM的表达收集分选后的AM及诱导获得的 骨髓衍生巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMDM)，按照 RNA小 提试剂盒说明书提取总RNA，然后按照cDNA反转录试剂盒说明书反转录合成 cDNA 后，进行 Real-time PCR 检测20 pl 反应体系：SYBR green(2x) 10 pl, PCR 上下游混合引物1 pl,引物序列如下:Gapdh上游引物：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3； Gapdh 下游引物：5‘-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3： PPARy 上游引物：5‘- GCTGGCCTCCCTGATGAATAA-3： PPARy 下游引物：5‘- TCCCTGGTCATGAATCCTTGG3, cDNA 模板 1 pl,蒸馏水 8 pl以 GAPDH 为内参基因，采用2-AACt计算目的基因的相对表达水平1.7小鼠AM吞噬功能的检测取小鼠胸腺研磨，并用45 pm筛网过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞浓度为 2x107个/ml，然后加入羧基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺脂（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE）,使其终浓度为 5 pmol/L,混匀后避光孵育 10 min，然后用4~5倍RPMI-1640培养基中和，冰上放置5 min , 1 500 r/min离心5 min，弃上清液，适量RPMI-1640培养基重悬,65 °C加热5 min , 冷却至室温获得CFSE标记的胸腺死亡细胞。

将分选后的AM按1x105 个/ml铺于24孔板中，置于37 C、5% CO2细胞培 养箱中培养24 h后，用预热的RPMI-1640培养基洗掉未贴壁的细胞，然后加入 荧光标记的吞噬靶标，例如依据细胞数量按1 ：10的比例加入CFSE标记的胸腺 死亡细胞或依据培养基体积按20 :1的比例加入带APC荧光的微球于37 C、 5% CO2细胞培养箱中孵育60 min ; RPMI-1640培养基洗3次，彻底去除未被 吞噬的细胞或微球；胰酶消化获得单细胞悬液，流式细胞仪检测AM的吞噬率1.8统计学处理采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计分析，结果均以表示， 两组之间比较采用t检验，Pv0.05表示差异有统计学意义2.1流式细。