PCR扩增技术(1).pptx
25页
PCR扩增技术,1,.,DNA聚合酶,引物,引物,2,.,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,3,.,94变性,50-65退火,XX延伸,4,.,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,5,.,72,94,55,PCR循环,6,.,一、PCR的基本原理,PCR技术实际上是DNA的体外扩增技术 其原理类似于DNA在体内的复制过程 只要提供一个合适的条件模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成DNA的体外合成 PCR反应是一个重复进行的DNA复制过程，需要重复进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、DNA聚合酶催化新链DNA的合成7,.,这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension），使DNA得以复制 1、变性 通过加热至95左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。
2、退火 将温度降至引物的Tm值左右或以下（比Tm低5，通常为5565），引物与DNA模板互补结合，形成杂交链8,.,3、延伸 在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的作用下，于7074以引物3端为起始点按53方向使DNA新链延伸 上述三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此经过2530个循环，可使新生的DNA片段得以扩增1069倍（至少扩增105 倍） PCR的反应原理也就是PCR的基本过程9,.,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,10,.,复性（退火）,11,.,延伸,12,.,变性,13,.,复性（退火）,14,.,延伸,15,.,变性,16,.,复性（退火）,17,.,延伸,18,.,1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 一般100ng DNA模板/100L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加PCR反应条件,19,.,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量20,.,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性21,.,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度22,.,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性23,.,（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,24,.,http:/,25,.,。
