环境雌激素双酚A对成年小鼠学习记忆和突触结构的影响-心理学报.doc

心理学报 2013, Vol. 45, No.9, 981 - 992Acta Psychologica Sinica DOI: 环境雌激素双酚 A 对成年小鼠学习记忆和突触结构的影响 *刘幸毅 1 徐晓虹 1,2 张 勤 1 张广侠 1 季佳琳 1 董芳妮 1 杨艳玲 1(1 浙江师范大学化学与生命科学学院 ; 2 浙江师范大学心理研究所 , 浙江金华 321004)摘 要 双酚 A (bisphenol, BPA) 是一种广泛存在的环境内分泌干扰物 , 它可与雌激素受体结合干扰内源性雌激素对中枢神经系统的调控作用本研究通过将 10 周龄小鼠灌胃染毒 BPA (0.4 、4、40 mg/kg/day)3 个月, 研究长期 BPA 暴露对成年小鼠记忆行为和突触可塑性的影响开场行为测试结果表明 , BPA (0.4 、4、40mg/kg/day) 增加雄性的站立次数和理毛频率 , BPA (4 mg/kg/day) 却显著减少雌鼠的站立次数水迷宫和被动回避行为模型检测显示 , BPA 主要损伤雄鼠的空间学习记忆和被动回避记忆通过制备海马 CA1 区超薄切片后 , 电镜观测发现 , BPA (0.4 、40 mg/kg/day) 暴露降低雄鼠海马 CA1 区突触数密度 , 缩短雄鼠突触前活性带长度 , 减小雄鼠突触后致密体 (PSD) 厚度 , 增加雄鼠突触间隙宽度。

进一步用 Western blot 方法检测突触前、后的标志性蛋白 Synapsin I 和 PSD95 以及兴奋性氨基酸 NMDA 受体 NR1 亚基和 AMPA 受体 GluR1 亚基蛋白的表达 , 发现 BPA 暴露致雄鼠 Synapsin I 、PSD95、NR1 蛋白表达水平下调而 BPA 对雌鼠的记忆行为、突触形态、突触蛋白和受体蛋白均没有明显作用以上结果提示长期 BPA 暴露性别特异性地影响成年小鼠的活动性和探究行为 , 损伤雄鼠的学习记忆 , 这些作用可能通过下调突触蛋白和 NMDA 受体的表达而负性影响突触结构可塑性 , 最终影响雄鼠的学习记忆功能关键词 双酚 A; 学习记忆 ; 突触形态结构 ; Synapsin I; PSD-95; NMDA 受体分类号 B8451 前言围生期 BPA 暴露对脑发育及其成年后神经行为的影响(Fujimoto, Kubo, & Aou, 2007; Gioiosa, Fissore,双酚 A (bisphenol A, BPA) 大量使用于食品和 Ghirardelli, Parmigiani, & Palanza, 2007; Gonalves,饮料的碳酸聚酯包装材料、 树脂内膜和牙齿固封剂 , Cunha, Barros,& Martnez, 2010; Xu, Zhang,Wang,以及各种化学日用品的添加材料。

来自一些发达国 Ye, & Luo, 2010; Patisaul, Fortino, & Polston, 2007;家的调查显示长期以来人们一直暴露于低剂量的 Patisaul & Bateman, 2008; Narita, Miyagawa, Mizou,BPA 中(Erler & Nova, 2010) 美国疾病控制中心的 Yoshida, & Suzuki, 2007; Negishi et al., 2004;报告显示 , 来自 394 份被测人群尿液样本中有 95% Kiguchi, Fujita, Lee, Shimizu, & Koshikawa, 2007) 检测出 BPA (Calafat et al., 2005) BPA 是一种兼有 然而, 性激素也参与调节成年脑的功能活动 , 因此,拟雌激素、 抗雌激素和抗雄激素活性的环境内分泌 推测长期暴露于 BPA 环境的成年人其神经行为可干扰物 , 它不仅可以低亲和性与雌激素受体结合 ,能会受到影响 有人发现在妊娠和哺乳期间长期暴还可与雄激素受体结合而干扰内源性激素对脑的 露于低剂量 BPA 的母鼠其母性行为发生改变 (Seta,调 节 作 用 (Leranth, Szigeti-Buck, Maclusky, & Minder, Dessi-Fulgheri, & Farabollini, 2005) 。

我们Hajszan, 2008)由于性激素在神经发育及其性别分 前期研究发现青春期暴露于 BPA 性别特异性的影化中的重要作用 , 大量的研究聚焦在发育期特别是响成年小鼠的探究、焦虑和学习记忆等多种行为收稿日期 : 2012 - 11- 27* 国家自然科学基金项目 (81172627), 浙江省自然科学基金重点项目 (Z2090955) 通讯作者 : 徐晓虹 , E-mail: xuxh63@; ： (0579)82282269981982 心 理 学 报 45 卷(田栋等 , 2011) 但成年期 BPA 暴露对行为的影响 g, 雌性体重 25~30 g, 购于浙江省金华市药检所极其机制知之甚少 小鼠雌雄分开饲养 , 每笼 10~11 只小鼠 , 饲养环境海马的突触可塑性与学习记忆行为密切相关 , 为昼夜 12 h 交替 , 饲养室温度控制在 18~22°C,湿雌激素可通过正向调节突触发生、 神经环路联系和 度在 50%~60%, 水和食物自由摄取小鼠适应 2突 触 传 递 而 促 进 突 触 可 塑 性 (Brinton, 2009; 周后, 随机分为 BPA 暴露组 (0.4, 4, 40 mg/kg/day)Woolley, 1998) 。

最近 , 有人发现 BPA 可以干扰性 (BPA, 99.8%, 上海生工生物工程技术服务有限公激素的突触重塑作用 (Hajszan & Leranth, 2010) 在 司)和溶媒对照组 (金龙鱼食用油 ), 每组雌雄各 22大鼠和灵长类 , BPA 可抑制雌激素和雄激素诱导增 只每天上午 8 点灌胃染毒 , 持续 12 周染毒结束加的海马和前皮层 70%~100%的棘突触 (Leranth & 3 天后进行实验Szigeti-Buck et al., 2008; Leranth, Hajszan, Szigeti- 2.2 行为测试Buck, Bober & Maclusky 2008; MacLusky, Hajszan, 各组小鼠在 BPA 暴露结束 3天后 , 按以下顺序& Leranth, 2005), BPA 暴露数天促进新生大鼠小脑 分别检测各项行为每次开始行为测试前 , 都对动蒲肯野氏细胞的树突生长和下丘脑神经元树突密 物进行 3 次抚摸用以适应行为学测试度 (Yokosuka et al., 2008; Shikimi, Sakamoto, 开场行为Mezaki, Ukena, & Tsutsui, 2004) 。

我们以往的研究 旷场箱为一正方形模型 (40 cm × 40 cm × 30发现 BPA 快速增加体外海马神经元树突丝密度和 cm), 分为 16 小格记录小鼠 1 min 和 5 min 内由运动性 (Xu & Ye et al., 2010) 突触界面是一个对行底面中心开始跑动所穿越的格数、 站立和理毛的次为训练和化学物质非常敏感的结构 , 其中的一些参 数穿越格数可评价小鼠运动活性 , 站立次数评价数, 如突触 间隙(synaptic cleft) 、突 触前活性带 小鼠在新异环境中的探究行为 , 理毛的次数反应动(synaptic active zone) 、突触后致密体 (postsynaptic 物在冲突状态下的一种转移行为 (Frye & Seliga,density, PSD) 和突触界面曲率 (curvature of synaptic 2001)各项指标由动物行为分析系统 (TSE Systeminterface) 可因刺激而发生改变 (Marrone & Petit, GmbH, 德国)记录每组 12 只动物 , 每只小鼠测试2002)雌激素改善卵巢摘除小鼠记忆行为的同时 结束后清除粪便及尿液 , 并用酒精擦拭旷场箱 , 然伴随有海马和前皮层突触界面结构的变化 , 包括突后进行下一只小鼠的测试。

触间隙 的缩小和 PSD 厚 度增加(Xu & Zhang, 水迷宫测试2006)位于突触后膜上的 PSD 含有细胞骨架和脚 开场行为测试后的第二天检测 , 每组 12 只动手架蛋白、谷氨酸受体、钙调蛋白结合蛋白、离子 物Morris 水迷宫 (Morris water maze) 用于检测动物通道和信号分子等多种蛋白 , 这些蛋白表达的改变 的空间学习记忆能力水迷宫为高 45 cm, 直径 90和相互作用均可影响突触活性和可塑性 , 同时也改 cm 的黑色圆柱形水池 , 水深 25 cm, 水温度控制在变 PSD 的 厚 度 (Trinidad, Thalhammer, Specht, 25±1℃, 一个直径为 10 cm 的黑色平台位于水下 1Schoepfer, & Burlingame, 2005)那么, BPA 影响成年 cm 处训练时将小鼠面向池壁放入水中 , 由摄像头神经行为是否与突触界面结构修饰的改变有关呢？ 记录小鼠 60 s 内在池中寻找平台的游泳轨迹 , 小本研究 通过将成年小鼠长期暴 露于低剂量 鼠找到平台并在平台上停留 15 s 后, 放回饲养笼BPA, 研究 BPA 对成年小鼠活动性、 探究、 学习记 内休息 30 s, 然后进行下一次训练。

如果小鼠在忆等行为的影响 , 观察海马 CA1 区神经元突触密 60 s 内找不到平台 , 就人为将小鼠放到平台上停度和突触界面结构的改变 ; 进一步通过 Western 留 15 s水迷宫人为划分为 4 个象限 , 每次在不同blot 检测 海马突 触蛋白 Synapsin I 和 PSD-95 象限将小鼠放入水中每天连续训练 4 次, 为期 4(postsynaptic density protein of 95 kDa), 以及兴奋 天由测试软件 (TSE System GmbH, 德国 )分析搜性氨基酸 NMDA 和 AMPA 受体表达的改变 , 探讨索路径BPA 影响行为和突触结构可塑性的机制 被动回避反应2 材料和方法水迷宫测试后的第二天检测 , 每组 12 只动物跳台实验用于检测动物被动回避电击的学习记忆2.1 实验动物模型制备与分组行为 被动回避反应箱为 15 cm × 15 cm × 30的cm清洁级 8 周龄 ICR 雌雄小鼠 , 雄性体重 30~35 塑料箱 , 箱底由直径为 0.3 cm 的铜栅栏铺设 , 间距9 期 刘幸毅 等: 环境雌激素双酚 A 对成年小鼠学习记忆和突触结构的影响 983宽度为 0.5cm。

箱内一角落放置一个高 2.5 cm, 直 (Media Cybernetics, USA) 计算突触数密度 ( ×10,000)径 5 cm 的橡胶平台作为动物回避电击的安全区 和测量突触界面结构 ( ×100,000) 每组 40 张照片 ,实验开始前将小鼠放置在回避箱内自由适应 3 min,测定过程采用 “双盲法 ”第二天将小鼠放置在橡胶平台上 , 当小鼠跳下平台 突触数密度测算时立即给予电击 (40V 交流电 ) 5 sec, 记录小鼠跳下 突触数密度 (Nv) 用立体计量学方法定量分析平。