肝硬化和肝癌动物模型构建实验.docx

肝硬化动物造模实验一、原理CCI4是使用最早、应用最广泛的诱导肝硬化动物模型的化学药品CCI4经肝微粒体细 胞色素P450激活生成三氯化碳（CCl3），后者攻击肝细胞膜结构上的磷脂，引起脂质过氧 化，破坏细胞的模型结构；CCl3还与细胞内蛋白质形成共价键，损害线粒体，使还原性辅酶A（ NADH ）与三磷 酸腺苷（ATP ）在肝内生成减少，脂肪酸氧化受到抑制，影响三羧酸循环，致使肝细胞"窒 息”死亡；内质网、线粒体、高尔基体甚至细胞膜的变形和破坏，导致蛋白合成、能量代谢和脂质 氧化障碍，三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积，出现脂肪变性，肝细胞坏死并发生纤维化高浓度CCl4主要累及中枢神经系统，低浓度反复应用则损害肝和肾，肝脏损害-修复- 损害最终形成肝硬化采用CCl4诱导肝硬化模型通常选用30%-60%浓度作为致模溶液， 以大鼠作为造模对象，通过皮下或腹腔注射、灌胃、蒸汽吸入或拌于食物中喂养等各种方法 输入动物体内二、模型特点模型制作观察过程中，模型动物精神萎靡，食欲不振，嗜睡，易激怒，时见相互间撕咬和攻击，体重先减轻后增加腹建注射30%CCl4溶液的动物在造模7周时，其血清丙氨酸 转氨酶（ALT）总蛋白（TP）球蛋白（GLO）总胆固醇（TC）三酰甘油（TG ）和肝组织TC、TG、L-羟脯氨酸（HPA）含量明显上升，血清白蛋白（ALB ）含量和白蛋白/球蛋白比 例（A/G）显著下降，光镜下全部模型动物肝组织出现纤维化，大部分形成假小叶；电镜下模型动物肝细胞超微结构明显异常，肝细胞呈不同程度的肿胀，部分肝细胞膜破 裂，内质网扩张断裂，常见大片脂质空区，线粒体基质电子密度增大，脊消失，肝窦中多见 中性粒细胞。

皮下注射40%、50%、60%CCI4溶液连续42-66 d，动物成活率为46%-77%，肝硬 化模型成功率为72%-100%成模动物正常肝组织被破坏、由广泛增生的纤维组织将原来的肝小叶分割包绕成大小不 等的圆形状，形成假小叶假小叶内肝细胞索排列紊乱，小叶中央静脉缺如、偏位或出现两个以上的中央静脉，再 生的肝细胞结节肝细胞索排列紊乱、胞体大、核大、着色深，肝细胞还出现气泡样变和脂肪 变性等三、 模型应用1. 肝硬化相关机制研究；2. 药物筛选和疗效评价；3. 比较医学研究等四、 实验动物大鼠五、实验方法成年雄性大鼠经其腹腔注射30%CCI4石蜡油溶液2ml/kg体重,2次/周连续7周 或皮下注射40%CCl4大豆油溶液3ml/kg体重首剂5ml/kg体重每3d 一次共14次， 期间，在实验开始后前2 周，饲以80%玉米面和20%猪油混合饲料，2 周后在饲料中混入 0.5%胆固醇，以30%乙醇作为唯一饮品，连续42d或皮下注射 50%CCl4 大豆油溶液 3ml/kg 体重，首剂 5ml/kg 体重，每 4d 一次，第 5次起，改为肌肉注射，共15次，期间饮10%乙醇替代饮水，食常规颗粒饲料，连续60d。

或皮下注射60%CCl4矿物油溶液3-5ml/kg体重，每4d -次，共15次，其中头4次 剂量为 5ml/kg 体重，5-11 次为 3ml/kg 体重，12-15 次为 5ml/kg 体重，同时以10%乙 醇作为唯一饮用水，连续66d造模过程中，每日观察动物的一般活动状况，每周称量动物体重，造模结束后抽取全血 制备血清、称取部分肝组织制备匀浆作生化检测，摘取肝脾等器官称重，计算脏器系数，并 作组织形态学检查肝癌动物模型构建1. 诱发性肝癌模型（实验中常用方法之一）诱发性肝癌模型一般是指使用特定的化学诱导剂诱导肝癌发生的过程常用的诱导剂包括二乙基亚硝胺（DEN）,黄曲霉素（AF）, 二甲基氨基偶氮苯（DAB ）等以下为DEN诱导的常用步骤：:化学逶耳剖勰（DEN ）发展过程：肝纤雉化f萨硬化一»肝煌优点：与人体肝瘩发展逗程基本一致，常用睦之一.0*25%DEN DEN DEN DENgy° 7 14 21 28a®：t 选依重约为15S200g的蔭性大鼠（吕D/F祐he『344）2. IS性大鼠園蹿素的圧抗作用诱导成功率低；玄 每周一次按照10mgAgJg喂大鼠Q25綁DfM*洛液；4.约16局后即可诱发肝瘪 ; > 営-；徑加左DEN 诱导是化学诱导中最常用的方法，也有2种或2 种以上的诱导剂同时诱导，虽然 会加速肝癌的发生，但是也会使动物死亡率升高。

2. 移植性肝癌模型（常见到的模型之一）移植性肝癌模型是实验研究中常见的模型之一，分为细胞移植（CDTX）和病人组织肿 瘤模型（PDTX）构建过程如下：一般构建方法：采用肝癌细胞（如MHCC-97L、Hep G2）或者肿瘤组织（病人来源） 先在免疫缺陷鼠（nude品系）皮下荷瘤，成功后再将肿瘤组织块切成2-3mm3块状，然 后再移植到小鼠的皮下或者肝脏，此法可以将成功率提高到95%以上缺点：① 因为肝癌发病机理相对复杂，目前的肝癌细胞系荷瘤成功率较低且生长缓慢；② 不能够完全模拟肝癌的发生过程，而且操作相对比较复杂 鉴于该模型的缺陷，今天为大家介绍一种：基于肝硬化的原位肝癌移植模型 优点：一种能够最大程度模拟人类肝癌发生过程，并先后经历了纤维化、肝硬化、肝癌，与人 体肝癌的发生进程基本一致简要流程如下所示：第一歩:肝硬化小鼠檯型的诱导1. 准备20%CCI. （CO»/橄機由 1 : 4）2. 准备小层，每组10只；每只小塞灌lg150nl CCI4I3. 每周三次，持续12周I4. 在最后一次处理后2 - 3天,称重开准备在肝硬化原位置种植HCC细胞iiJS：诱导时期较长・应采用口眼可以更好地使小踰受；灌喂操■（囱要,匮免灌入I盛从而使小鼠室息死亡；给药期间密切监测小鼠的健廣状况亠 Tumor mocutetoond 1CCI4 admimsbon ♦} ] ]• Tumor formabotvWeekO Week 12 WwklVU第二步：肝癌卿胞的原拉种植1. 用50%®^胶重暮kKife仙琲胡的HOV阔胞.毎只小鼠1（/个挖仲1体泵；2. 麻醉小鼠：龌用戊巴比爰钠或吾阿氟丁厨刚'鼠，麻醉后绑定；3. 剃毛后沿蹬中坯切开皮肤,快麼丸m左右f祐出剑状软爵」将切口执开；4. 先綁签撞用生理啟水濯浦.然启将胖左叶（撮大的一吋｝用梯签挑起；I5-餵懂注射20口1圳胞悬液,注射信停田血，旋转週出针头・邂免蜩胞回渝， 拄射成功后在肝脏部位一般能■封白色突起6.注射完华后消超曲腔.恋后童合饬口*肝原位肿瘤的检测：一般1 -2周后即可长成块状肿瘤组织，可以使用CT检测。

或通过 注射D-去甲荧光素，检测荧光强度来判定肿瘤长势3. 基因工程肝癌模型中国肝癌患者中乙肝病毒（HBV ）或丙肝病毒（HCV ）阳性率高达80%，可见HBV或者HCV是诱导肝癌的重要因素由于人的HBV和HCV不能诱导小鼠或者大鼠发生肝炎 和肝癌，建立这些模型时通常需要嵌入人肝细胞构建方法：一般通过转基因的方法把HBV/HCV的DNA序列整合到小鼠的宿主基因 组中，从而构建HBV/HC V感染慢性携带者的转基因小鼠模型本期肝癌模型的建立就介绍到这里，回顾一下，因为肝癌的发生一般经历“肝炎——肝 硬化——肝癌”三大步，所以为了更接近人类肝癌发展过程，建立肝癌模型时我们需要遵循 这个过程用的较多就是DEN诱导模型、基于肝硬化的原位肝癌移植模型及基因工程小鼠 在实验中，你需要根据你的实验目的选择最准确的肝癌动物模型。