酶的制备及试剂配置方法.docx

试剂(1) LB： 250ml 中含进口 OXID 胰蛋白豚 2.5g, OXID 酵母提取物 1.25g, NaCl2.5g； 250ml/500m l 瓶；(2) AMP： 100mg/ml；(3) 溶菌酶：10mg/ml；(4) PLP：(5’磷酸毗哆醛)1mM；(5) PBS： 1L 中含 NaCl 8g, Na2HPO4.12H2O 3.58g, KH2PO4 0.2G,KCl 0.2g, 121°C20min 灭菌；(6) NPI-400: PBS中含咪唑至400mM，调节pH值至7.4左右；(7) NPI-1: PBS 稀释至 1mM；(8) NPI-20: PBS 稀释至 20mM；(9) NPI-30: PBS 稀释至 30mM；(10) 100mM L-蛋氨酸：100ml水中加入1.4921g蛋氨酸充分溶解，4C避光保存11) 0.1M 磷酸钾缓冲液(pH8.0):每 100ml 缓冲液中含 21.45g K2HPO4 -3H2O,0.82gKH2PO4 ,加入80ml蒸馏水，充分溶解后加水至总体积为100ml12) 三氯乙酸(TCA)：质量体积比为4.5%,100ml蒸馏水中加入三氯乙酸4.5g，充分溶解 待用。

13) 醋酸钠缓冲液(pH5.2)： 5.88g NaOH加入100ml蒸馏水，溶解后加入9.55ml冰醋酸， 加入蒸馏水至总体积为200ml14) 0.05% 3-甲基-2-苯并噻唑酮踪：100ml蒸馏水中加入0.05g3-甲基-2-苯并噻唑酮踪， 充分溶解后4C避光保存)NPI-200: PBS稀释至200mM；(15) IPTG: 1M, 0.22um 滤膜除菌；(16) 1%冰醋酸：体积比为1%的冰醋酸二、制备：(1) 菌体的活化：250ml培养瓶中接入1ml冻存培养液，AMP按1： 1000加入，37C180rpm 过夜；(2) 扩大：1： 20比例接入250mlLB培养基中，37C180rpm 培养1.5h；(3) 诱导：加入IPTG至终浓度为0.5mM，即每250ml中加入125ul IPTG, 16C100rpm, 24h；(4) 收集菌体：每50ml离心管中加入约50ml菌液，4C4000rpm离心15min，弃上清，再 加入50菌液，相同条件收集菌体；(5) 清洗：4C预冷的PBS重悬菌体，相同条件离心收集菌体；(6) 冻融：每50ml离心管中加入10mlNIP-1 , 200ulPLP, 400ul溶菌酶，重悬菌体，-20C 和室温反复3次；(7) 破碎：每两管合并一管，冰浴，超声条件：工作5、，间隙15s,循环30次，功率200w；(8) 分离上清：4C10000rpm离心10min收集上清，0.22um滤膜过滤；(9) 过柱纯化：说明：组氨酸纯化柱为上海悦克生物产品，规格分别为1ml/5ml/10ml,制备使用蛋白样品为 10ml柱，柱的处理方法可按照说明书进行操作。

1、 柱的前处理：倒出保存柱所用的20%乙醇，并加入PBS清洗10倍柱体积；2、 柱的平衡：加入NPI-1 10倍柱体积；3、 上样：将制备处理好的上清样品加入柱中，约80ml上清液/10ml柱；4、 洗壁：加入0.5倍住体积的NPI-1,清洗柱壁上残留的样品；5、 洗杂蛋白：加入10倍柱体积的NPI-20, 10倍柱体积的NPI-30；6、 洗脱目的蛋白：加入4倍柱体积的NPI-200，前1倍柱体积液体不收集，从第二个住体 积开始用灭好的50ml离心管收集；7、 加入4倍柱体积的1%冰醋酸，加入PBS平衡，可再过样品纯化8、 后处理方法按说明书进行操作10) 目的蛋白的透析:将装有目的蛋白约30ml的样品装入透析袋中，系好，装入含有1LPBS 的透析液中，并加入100ul PLP，200ul0巯基乙醇，4°C，磁力搅拌器搅拌，每12小时换一 次透析液，共换5次11) 目的蛋白的浓缩：将含有蛋白样品的透析袋放入饭盒中，下面铺上蔗糖，用滤纸覆盖， 上方压一含100ml水的小瓶，4C过夜浓缩12) 蛋白样品的收集：用移液器，将样品从透析袋中转入至灭好的50ml离心管中，计录 蛋白体积，约每3L培养液可收集得到10ml蛋白样品。

13) 酶蛋含量测定：利用考马期亮蓝测定蛋白含量的方法，测定蛋白含量在8mg/ml左右 为达标。