牛奶中酪蛋白和乳糖的分离与鉴定.pdf

湖南工程学院应用技术学院专业综合实验牛奶中酪蛋白和乳糖的分离与鉴定前言牛奶是营养最完备的食品之一，这一点已为许多人认识并接受尤其是在婴儿及青少年时期，每天一定量的牛奶能促进身体健康成长牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，这些都是人体发育所必不可少的物质牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白酪蛋白是含磷蛋白质的复杂混合物，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性，把牛奶的值调到酪蛋白的等电点(p=4.8)来沉淀分离酪蛋白酷蛋白不溶于乙醇和乙醚，所以可用乙醇和乙醚将其中的脂肪洗涤除去牛奶中的糖主要是乳糖乳糖是一种二糖它是唯一由哺乳动物乳糖合成的糖，它是在乳腺中被合成的乳糖是成长中的婴儿建立其发育中的脑子和神经组织所需的物质乳糖也是不溶于乙醇的，所以，当乙醇混入水溶液中时,乳糖会结晶出来,从而达到分离的目的1 材料与方法1.1 材料（1）实验仪器恒温水浴锅、抽气抽滤瓶、布氏漏斗、蒸发皿、烧杯 600ml、100ml 各一个、表面皿、天平、玻璃棒2）主要试剂10%醋酸溶液、95%乙醇、乙醚、奶粉、精密pH 试纸（pH=35）、碳酸钙、滤纸、1%CuSO4 溶液、10%NaOH 溶液、茚三酮溶液、30%Acr 单体贮液、浓缩胶缓冲贮液等。

1.2 方法1.2.1酪蛋白的分离称取 29g 奶粉溶解于 100ml 温水中，取三份 20ml 牛奶于 100ml 烧杯中，在恒温水浴中加热至45，边搅拌边慢慢加入10%醋酸溶液，通过 pH 试纸测量至牛奶 pH 分别为 4.8、4.6 和 3.8放置冷却、澄清后，抽滤注意先将上层清液滤出一部分，再将沉淀倾入漏斗中进行抽滤得沉淀（滤完后，收集滤液，并在滤名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 6 页 -湖南工程学院应用技术学院专业综合实验液中加入少量粉状碳酸钙留作乳糖的分离）用蒸馏水洗沉淀2 次，离心 10min（3500r/min），弃去上清液，在沉淀中加入30ml 乙醇搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤再用乙醇-乙醚混合液（1:1）洗涤沉淀 2 次，最后用乙醚洗涤沉淀 1 次（用乙醚洗涤时，注意用玻璃棒捣碎成团的固体，并反复翻洗，保证脂肪被洗净），抽滤得沉淀将沉淀摊开在表面皿上，风干的酪蛋白纯品准确称重，计算含量和得率含量：酪蛋白（g/100ml 奶粉液）=测得含量/理论含量 100ml 式中理论含量为 2.5g/100ml 奶粉液1.2.2酪蛋白的鉴定（在酪蛋白分离后立即完成效果最好）取少量酪蛋白颗粒于试管中，加入25ml 水溶解。

取 5ml 酪蛋白溶液，加入茚三酮溶液 5 滴，振荡，放入沸水浴中加热2 分钟，溶液呈淡紫色茚三酮反应）茚三酮溶液的配制：1g 茚三酮 溶于 35ml 热水，加氯化亚锡 0.04g（防腐），过滤后于暗处放置24h，定容至 100ml 后使用取 5ml 酪蛋白溶液，加入 10%NaOH溶液 1ml 后，滴入 1%CuSO4溶液 0.5ml振荡试管，溶液呈蓝紫色缩二脲反应）取 10ml 酪蛋白溶液，加入浓硝酸1ml 后加热，有黄色沉淀生成再加入10%NaOH 溶液 1ml，沉淀为橘黄色蛋黄颜色反应）1.2.3酪蛋白的电泳分析-SDS-PAGE A.试剂的制备：30%Acr 单体贮液：14.55g Acr+0.45g Bis，先用 40ml 双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50ml，过滤用棕色瓶可在 4保存一个月，两种单体和溶液都是中枢神经毒物，要小心操作浓缩胶缓冲贮液（1 M Tris-HCl，pH 6.8）：6.06g Tris溶解在 40 ml 双蒸水中，用 4 M 盐酸调节 pH 至 6.8，再用双蒸水加至50ml，4保存分离胶缓冲贮液（1.5 M Tris-HCl，pH 8.8）：9.08g Tris溶解在 40ml 双蒸水中,用 4 M 盐酸调节 pH 至 8.8,再用双蒸水加至50ml,4保存。

10%SDS：25g SDS,用双蒸水溶解至250ml,室温保存10%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵+1ml 双蒸水.关于 10%过硫酸铵的保名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 6 页 -湖南工程学院应用技术学院专业综合实验存时间，文献上一般介绍需使用前新鲜配制，但据我们的经验，在-20可保存一年，4可以保存一个月SDS样品缓冲液：SDS 2g+2ml 疏基乙醇+3ml 甘油+40mg 溴酚蓝+0.2mol/L pH 7.2PBS 10ml 溶解SDS电极缓冲液：3.0275gTris+14.4134g甘氨酸+0.1%SDS（pH8.3）染色液：0.1%考马斯亮蓝 R-250+40%甲醇（乙醇）+10%冰醋酸脱色液：10%甲醇（乙醇）+10%冰醋酸B.检测：洗板和装板洗净电泳玻板，直至玻板不挂水珠，凉干；将两支封条放在两块玻板（其中一块玻板有凹槽）之间的左右两边，用透明胶纸密封玻板的左右和下边（没有凹槽），再用夹子夹住玻板，垂直放置配分离胶用 10%丙烯酰胺凝胶，分离胶体积6ml，按如下体积吸取各种贮存液：灭菌去离子水 2.28ml；30%丙烯酰胺溶液2.04ml；1.5mol/LTris(pH 8.8)1.56ml；10%SDS0.06 l；10%过硫酸铵 0.06 l 玻板封底用 EP 管取 1.0 ml，加 0.4 lTEMED，迅速混匀，迅速加入玻板中灌分离胶其余的分离胶加入2.0 l TEMED，混匀（注意不要产生气泡），沿玻板壁缓缓加入两块玻板之间（注意不要产生气泡），上面覆盖一层灭菌去离子水（隔离空气），以利于丙烯酰胺的聚合。

静置 2030 分钟，若丙烯酰胺聚合可见凝胶与水层之间明显的界面配浓缩胶按如下体积吸取各种贮存液，配制 2.5ml 浓缩胶：灭菌去离子水 1.7ml；30%丙烯酰胺溶液 0.425ml；1.0 mol/L Tris(pH 6.8)0.325ml；10%SDS 0.025 l；10%过硫酸铵 0.025 l；TEMED 1l 混匀（注意不要产生气泡）灌浓缩胶待分离胶聚合后（2030 min），倒掉上层的水将混匀的浓缩胶沿玻板壁名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 6 页 -湖南工程学院应用技术学院专业综合实验缓缓加在分离胶上面，然后插上梳子，静置2030 分钟样品处理取 10 l 样品液于 1.5 ml EP 管中，加入等量的样品处理液，煮沸5min注意：EP 管盖须扎一针孔，以免沸液将管盖冲开处理一个标准分子量mark 作为标准物质加样待浓缩胶聚合后（2030 min），撕去透明胶纸，缓缓取出梳子将两块玻板夹在电泳槽上，形成电泳上槽将 1 电泳缓冲液倒满上槽，其余的倒入下槽用微量加样注射器吸取20 l 样品，缓缓加到加品孔底部，每加完一个样品需用水清洗微量加样注射器。

样品加完后，如有剩余的加样孔，应加上等体积的 1 SDS凝胶加样缓冲液（目的是使凝胶的负载均匀）电泳将电泳槽与电泳仪相接，正极（红色）接下槽打开电源，恒压 120 V 电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶（分离胶与浓缩胶之间有一可见的界面），约 20 min，将电压调高至 200 V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约90 min），关闭电源染色与脱色将电泳完成的凝胶从电泳槽中取出,去除浓缩胶,将分离胶放置于染色液中进行染色 30 分钟后,将分离胶片取出放入脱色液中进行脱色,脱色完成后进行观察,1.2.4 乳糖的分离将上述滤液 用倾滗法倒至蒸发皿中，用蒸汽浴浓缩至5ml 后，将热的混合物用布氏漏斗抽滤，除去沉淀的蛋白质和残余碳酸钙加热滤液，在热的溶液中加入 95%乙醇 18l，并继续加热，待其混合均匀后，趁热过滤，滤液应澄清把滤液移至锥形瓶中，加塞，放置1-2 天，让乳糖充分结晶抽滤，分离出乳糖晶体，并用冷的 95%的乙醇水溶液洗涤产物，待其干燥后称重2 结果与分析称重得分离所得的络蛋白重量为0.41g，则奶粉中络蛋白的含量为2.05g/100ml 乳糖的分离实验中得到少量的乳糖晶体，过滤后晶体全都附着在看滤纸上，名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 6 页 -湖南工程学院应用技术学院专业综合实验无法称取其重量。

此照片为络蛋白的电泳结果照片3 结论3.1 不同 PH 值的酪蛋白的实验现象PH 值调到 3.8 的牛奶,酪蛋白迅速沉淀下来，抽滤的速度也很快，鉴定酪蛋白的几个性质试验现象都十分明显，而且滤液十分澄清PH 值调到 4.8 的牛奶，酪蛋白的沉淀速度很慢，抽滤的速度也很慢，而且抽不干，滤液是浑浊的PH 值调到 4.6 的牛奶，酪蛋白沉淀速度和抽滤速度处于上面两种情况的中间酪蛋白，性质试验现象明显滤液略显乳白色3.2 奶中脂肪的影响脂肪也是牛奶的主要成分之一，约占牛奶的3.9%,在分离酪蛋白时，脂肪回夹杂在酪蛋白中一起沉淀出来因此，在用乙醚洗涤酪蛋白时，应把任何形状的酪蛋白捣碎，并用玻璃棒搅拌约10min，尽可能出去脂肪否则，酪蛋白长时间放置后会焦化变黄3.3 碳酸钙的作用本实验中所使用的碳酸钙，主要是用以中和过剩的乙酸，避免在后面的实验中乳糖在酸性条件下水解，从而影响收得率4 总结名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 6 页 -湖南工程学院应用技术学院专业综合实验通过本次综合实验,进一步提高了我们的实验操作技术,特别是加强了生物实验重要的电泳技术的练习我们将理论与实践互相结合,学到知识的同时能过熟练的运用这些知识解决一些实际的问题,这对于我们的未来是有很大的帮助。

名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 6 页 -。