胡萝卜素含量测定.docx

食物中胡萝卜素的测定方法Method for determination of carotene in foods1 主题内容与适用范围 本标准规定了食物中胡萝卜素的测定方法——纸层析法 本标准适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为》go2 原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色纱分离；剪下含胡萝 卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定3 试剂@石油醚（沸程30〜60D :同时是展开剂丙酮：分析纯丙酮-石油醚混合液：3： 7（V/V ） o无水硫酸钠：分析纯5%硫酸钠溶液1： 1氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50mL水无水乙醇：需经脱醛处理B-胡萝卜素标准溶液：取5mgB-胡萝卜素标准品，溶于10mL三氯甲烷中， 浓度约为500 »g/mL，准确测其浓度取标准溶液》L,加正己烷，混匀，测吸光值，比色杯厚度lcm,以正己烷为空 白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值计算公式： (1)$式中：XI——胡萝卜素标准溶液浓度，mg/mL；A——吸光值；E B -胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度为1cm,溶液浓度为1ppm的吸光系数，为； 将ppm,换算成mg/mL；——测定过程中稀释倍数的换算。

B-胡萝卜素标准使用液：将已标定的标准液用石油醚准确稀释后，每毫升溶 液相当50»g，避光保存于冰箱中4 仪器和设备实验室常用设备玻璃层析缸分光光度计旋转蒸发器：具150mL球形瓶恒温水浴锅皂化回馏装置点样器或微量注射器新华滤纸：定性，快速或中速，101 号5 样品的采集和处理粮食：样品用水洗三次，置60*烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包 樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎， 用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用6 测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）]样品提取取适量样品，相当于原样1〜5g （含胡萝卜素约20〜80»g）的匀浆，粮食样品 视其胡萝卜素含量而定，置100mL带塞锥形瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL, 振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100mL5%硫酸钠溶液的分液漏斗中， 再于锥形瓶中加入10mL丙酮-石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液 并入分液漏斗中如此提取 2〜3 次，直至提取液无色为止植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品（V10g=，加脱醛乙醇30mL， 再加10mL1： 1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂 化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。

洗涤将提取液（）静置分层，弃去下层水溶液，反复用 5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每 次约 15，直至下层水溶液清亮为止将皂化后样品提取液（）用水洗涤至中性将或的石油醚提取液通过盛有 10g 无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量 石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内浓缩与定容将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为 60*，蒸发至 约 1mL 时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入石油醚定容，备层析用纸层析点样：在18cmX30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、 D四点（如图1所示），吸取〜浓缩液在AB和CD间迅速点样图1展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚 饱和的层析缸中，进行上行展开洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将 位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有 5mL 石油醚的具塞试管 中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中比色测定用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度，以其值从标准 曲线上查出B-胡萝卜素的含量，供计算时使用。

标准曲线绘制取-胡萝卜素标准使用液（浓度为50»g/mL） 分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为，标准曲线各点胡萝卜素含量 依次为 》g为测定低含量样品，可在0至》g间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线（见图 2）图 2 实测图例胡萝卜素标准曲线图7 计算 （2）式中：X2——样品中胡萝卜素的含量，以B-胡萝卜素计，mg/100g；% 在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量，》g; 点样体积，mL；――样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，mL；样品质量，go8 结果的允许差同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值、应用范围该方法用于预混料中B—胡萝卜素的定量分析2、原理样品被KOH水溶液皂化，B—胡萝卜素被乙醇和环己烷萃取出来，用乙醇和异丙醇稀释后， 用分光光度计测定B—胡萝卜素含量3、 分析过程3mol/L的KOH溶液：将溶于水，然后定容到样本溶液配制精确称取含大约lOmgB—胡萝卜素到锥形瓶中加入20ml 3mol/L的KOH溶液，在651 （超声或水浴中震摇）15min,冷却后加入环己烷和无水乙醇，用磁搅拌子以700转/分的速 度搅拌至少5min，（或强烈震摇10min,使均匀），取该溶液lml用异丙醇定容到10ml在最大 波长452nm测定吸光度，用异丙醇做空白。

4、 计算结果A （吸光度）X稀释量X（校正因子）取样量（mg）X250A （吸光度）X50 （环己烷量）X10 （异丙醇定容量）X（校正因子） 取样量（mg）X2501%B—胡萝卜素取一GB/食物中胡萝卜素的测定本方法检出限：髙效液相色谱法为kg （L），线性范围为0~100mg/L；纸层析法为ug, 线性范围1 ng〜20ng第一法髙效液相色谱法2. 原理试样中的B-胡萝卜素，用石油醚 丙酮（80 20）混合液提取，经三氧化二铝柱纯化， 然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量3 试剂石油醚：沸程30r~60ro甲醇：色谱纯四氢呋喃三氯甲烷乙腈：色谱纯三氧化二铝：层析用，100-200目，1401活化2h,取出放入干燥器备用含碘异辛烷溶液：精确称取碘1mg，用异辛烷溶解并稀释至25mL，摇匀备用a-胡萝卜素标准溶液：精确称取1mga-胡萝卜素，加入少量三氯甲烷溶解，然后用 石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入25mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为40ug/mL， 放入-181储存备用B-胡萝卜素标准溶：精确称取B-胡萝卜素于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用 石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250 ug/mL。

-181储存备用二个月内稳定根据所需浓度取一定量的B-胡萝卜素标准液用移动相稀 释成100卩g/mLB-胡萝卜素标准使用液：分别吸取B-胡萝卜素标准溶液 于10mL容量瓶中，各加移动相至刻度，摇匀后，即得B-胡萝卜素标准系列，分别含B-胡萝卜素5、10、20、30、40、50ug/mLB-胡萝卜素异构体：精确称取B-胡萝卜素于10mL容量瓶中，充入氮气，快速加入含 碘异辛烷溶液10mL，盖上塞子，在距20W的荧光灯30cm处照射5分钟，然后在避光处用真 空泵抽去溶剂，用少量三氯甲烷溶解结晶，再用石油醚溶解并定容至刻度，浓度为150卩 g/mL, -18°C保存4仪器高效液相色谱仪离心机旋转蒸发仪5分析步骤试样提取淀粉类食品：称取试样于25mL带塞量筒中（如果试样中B-胡萝卜素量少，取样量可 以多些） ，用石油醚或石油醚丙酮（8 0 20）混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转入 蒸发器中，重复提取直至提取液无色合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干（水浴温度 为 30C）液体食品：吸取试样于250mL分液漏斗中，加入石油醚 丙酮（80 20） 20mL提取，然 后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。

合并提取 液，在旋转蒸发器蒸发至干（水浴温度为40 C） 油类食品：称取试样于25mL带塞量筒中，加入石油醚 丙酮（80 20）提取反复提取， 直至上层提取液无色合并提取液，于旋转蒸发器蒸发至干纯化将，，的试样提取液残渣，用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝层析氧化铝柱 为（内径）X4cm （髙）先用洗脱液丙酮石油醚（5： 95）洗氧化铝柱，然后再加入溶解 试样提取液的溶液，用丙酮 石油醚（5： 95）洗脱B-胡萝卜素，控制流速为20滴/min， 收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度用微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用测定参考条件：色谱柱：Spherisorb C18 柱 mmX 150mmo流动相：甲醇乙腈（90 10）流速：min波长：448nm试样测定：吸取“”项已纯化的溶液20ul依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含 B-胡萝卜素的量标准曲线：分别进标准使用液20ul，进行HPLC分析，以峰面积对B-胡萝卜素浓度画 标准曲线6结果计算见式（1）VXC 1X= X1000X （1）m 1000X1000式中：X —试样中B-胡萝卜素的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg或g/l）；V —定容后的体积，单位为毫升（mL）；#C —试样中B-胡萝卜素的量（在标准曲线上查得），单位为微克每毫升（ng/mL）；m—试样的量，单位为克或毫升（g或mL）；计算结果保留两位有效数字。

7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％第二法纸层析法8 原理试样经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开 剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜 素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定9 试剂石油醚（沸程30OC〜600 :同时是展开剂氢氧化钾溶液（1 1）：取50g氢氧化钾溶于50mL水无水乙醇:不得含有醛类物质检验方法：银氨液：加浓氨水于5%硝酸银液中，直至氧化银沉淀溶解，加入L氢氧化钠溶液数 滴，如发生沉淀，再加浓氨水使之溶解银镜反应：加2mL银氨液于试管内，加入几滴乙醇摇匀，加入少许mol/L氢氧化钠 溶液加热如乙醇中无醛，则没有银沉淀，否则有银镜反应脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入 1L乙醇中，暗处放置两天（不时摇动，促进反应），过滤，滤液倾入蒸馏瓶中蒸馏，弃去 初蒸的50mL乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加无水硫酸钠B-胡萝卜素标准溶液B-胡萝卜素标准贮备液：准确称取B-胡萝卜素标准品，溶于三氯甲烷中，浓度约为 500 u g/mL，准确测其浓度。

标定浓度的方法如下：取标准贮备液UL,加正己烷，混匀测其吸光度值，比色杯厚度为1cm以正己烷为 空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值按式（1）计算溶液浓度：A%2)X= X 式中：X —胡萝卜素标准溶液浓度，单位为微克每毫升（Ug/mL）；A --吸光度值；E —B胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm,比色杯厚度lcm,溶液浓度为 lmg/L的吸光系数，为； 测定。