S无菌检验验证方案.pdf

无菌检查方法验证方案无菌检查方法学验证方案版次：□ 新订□ 替代: 制 定 人：年月日审批会签：年月日批 准 人：年月日生效日期：年月日无菌检查方法验证方案 一、目的当建立医疗器械无菌检查法，或产品原材料改变，试验条件改变时应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该医疗器械的无菌检查二、范围适用于本公司生产的 ********的无菌检查方法验证三、验证依据《中国药典》 ——2010 版，附录：无菌检查法ISO11737-2:2009 医疗器械的灭菌 ——微生物学方法，第一部分：确认灭菌过程的无菌试验GB/T 14233.2-2005 医用输液、 输血、注射器具的检验方法， 第二部分： 生物学试验方法四、验证机构组成及职责：姓名部门及职务验证工作中的职责*** 质量管理中 心 总监负责组织验证方案、验证报告审批 质量管理中 心 QA 部部长负责组织现场监控、 QC 人员检验安排及审核检 验数据；协助起草验证方案，完成验证报告 质量管理中 心 QC 检验员负责实验过程检验项目的实施*** 质量管理中 心 QC 检验员负责实验过程检验项目的实施*** 人力资源中 心 总监负责组织验证人员的相关培训及资质评定。

五、方法验证5.1 验证条件5.1.1 检验环境：无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行操作其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染5.1.2 检验设备：主要的仪器、设备确认情况（附表1）无菌检查方法验证方案5.1.3 培养基及稀释液： 硫乙醇酸盐流体培养基、 改良马丁液体培养基、 改良马丁琼脂培养基、营养肉汤， pH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液、 0.1%蛋白胨水溶液、 0.9%无菌氯化钠溶液培养基灵敏度评价附表2）5.1.4 其它实验材料：微孔滤膜（孔径≤0.45um ，直径约 50mm） 、无菌过滤杯、无菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml） 、酒精灯、三角烧瓶、接种环5.2 方法验证5.2.1 原理：活检钳的形状为不溶物，为微生物转移更彻底，验证试验结果更准确，特选用无菌检查法中的薄膜过滤法5.2.2 供试品的取样按照GB/T 2828.1-2003相关规定进行取样5.2.3 菌种所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B) 26 003〕大肠埃希菌 （Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) 〔CMCC(B) 64 941〕白色念珠菌 (Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕黑曲霉 (Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕5.2.4 菌悬液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养 18小时～ 24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养 24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100cfu（菌落形成单位）的菌悬液接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养 5～7天，加入3～5ml含0.05％（ ml/ml）聚山梨酯 80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯 80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于 100cfu 的孢子悬液菌悬液在室温下放置， 应在2小时内使用； 若保存在 2～8℃可在 24小时内使用 黑曲霉孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内使用5.2.5 薄膜过滤法无菌检查方法验证方案取6根供试品，剪断置 600ml 0.1%蛋白胨水溶液中，充分振摇，平均加入至6个无菌过滤杯中，按薄膜过滤法过滤，每杯加入pH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液 100ml，冲洗三次，在最后一次的冲洗液中加入 50—100cfu的试验菌，过滤取出带有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的滤膜分别接种至100ml硫乙醇酸盐流体培养基中，带有白色念珠菌、黑曲霉的滤膜分别接种至 100ml改良马丁培养基中另取六份装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照阴性对照：培养基空白对照、冲洗液/缓冲液空白对照、无菌滤膜空白对照5.2.6 培养条件硫乙醇酸盐流体培养基：30℃～35℃，3～5天改良马丁培养基： 23～28℃，3～5天5.2.7 结果判断a.阴性对照应无菌生长。

b.与对照培养基比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、 更换滤膜品种等方法， 消除供试品的抑菌作用， 并重新进行方法验证试验六、验证结果的汇总、评定及审批6.1 阳性对照：一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2 的最小检验数量作阳性对照用6.2 阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu ，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量阳性对照管培养48～72 小时应生长良好6.3 按照方法验证方案的要求实施验证，并将验证过程记录在验证报告中对验证的结果进行分析和评价，并建议何种条件下进行再验证。

附表4）无菌检查方法验证方案 七、附表附表标号附表名称附表 1 主要仪器、设备的确认附表 2 培养基灵敏度检查评价附表 3 无菌检查方法学验证试验记录附表 4 验证评价、建议无菌检查方法验证方案 附表1：主要仪器、设备的确认序 号检测设备名称测量范围校正单位有效期检查结果结论：检验人 /日期：复核人 /日期：无菌检查方法验证方案 附表2：培养基灵敏度检查评价培养基名称培养基批号检测日期检测结果评价评价人：年月日备 注无菌检查方法验证方案 附表 3：无菌检查方法学验证试验记录产品名称生产批号灭菌日期检验数量接种培养记录培养基名称硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基培养基批号培养基用量接种菌悬液金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌菌悬液编号菌管编号Ⅰ +供试品ⅡⅢ+供试品ⅣⅤ+供试品ⅥⅦ+供试品ⅧⅠ+供试品ⅡⅢ+供试品Ⅳ菌种接种量第一天第二天第三天第四天第五天结果判定总结论备注检验人 /日期：复核人 /日期：无菌检查方法验证方案附表4：验证评价、建议验证项目编号评价和建议评价人：年月日再验证建议再验证：若该产品的原材料改变或试验条件发生改变时，检查方法应重新验证。