各种酶活性测定方法.docx

各种酶活性测定方法第一 超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase, SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴 离子自由基的酶本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定 酶活性大小在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易 再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲月宗，后者在560nm处有最大吸收而SOD 可清除o2,从而抑制了甲腙的形成于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低， 反之酶活性愈高据此可以计算出酶活性大小二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二） 仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管 处照度为4000Lx） ； 5.试管或指形管数支三） 试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液（）；2. 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷 酸缓冲液定容至100ml；|imol/L氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保 存；4. 100|imol/L EDTA—Na?溶液：称取一Na?用磷酸缓冲液定容至 1000ml；5. 20|imol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、 实验步骤1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预 冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml取〜2ml于1000rpm下离心 20min，上清液即为SOD粗提液2. 显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下 列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L磷酸缓冲液L Met溶液L 750|imol/L NBT 溶液 |dmol/L 100^mol/L EDTA—Na?液 ^mol/L 20|imol/L 核黄素 ^mol/L 酶液支对 照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000LX日光 下反应20min （要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的 吸光度四、 结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活 性SOD 总活性=（A —A）XV/（A XXWXV）ck E ck t上式中，SOD比活力=SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活 力单位以酶单位/ mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积 （ml） Vt测定时样品用量（ml） W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白/g鲜重。

SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法 缩写：SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；POD：过氧化物酶；MDA:丙二醛；PVP： 聚乙烯吡咯烷铜K-30； L-Met：甲硫氨酸；NBT:氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA:三氯乙酸；PBS:磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：(V=3ml)磷酸缓冲液：L-Met: NBT:EDTA-Na2: 核黄素：酶液：蒸馏水： 试剂配制：(1) L PBS：(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met 用 PBS 定容至 100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用 PBS 定容至 100ml (避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g 用 PBS 定容至 1000ml(5) 20umol/L核黄素：0.0753g用蒸馏水定容至1000ml (避光保存)注：(1)对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2)照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值 的测定方法 试剂配制：(1) 5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml(2) % TBA： 2.5g 用 TCA 定容至 500ml方法：酶液1ml —%TBA和5%TCA一混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心 10min一用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值的测定方法试剂配制：(1) L的醋酸缓冲液：+得到的醋酸缓冲液AL的HAc溶液)一6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中BL的NaAc溶液)一(2) %愈创木酚溶液一125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中(临用 前配制)(3) %H2O2溶液：30% H2O2定容至50ml (临用前配制)方法：比色杯中依次加入2ml L的醋酸缓冲液一1ml %愈创木酚溶液一xml酶液(5min值为 500-800即可)一 ％H2O2溶液一迅速巅到混匀把A460调零并开始计时一1次/30s，连续读取 3min的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L 的 PBS () (2) % H2O2—1ml H2O2 定容至 100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS ()为空白把A240调零(2) 50ul酶液一3ml 50mmol/L的PBS () — % H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时一1mi n后在 240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。

2010年06月22日星期二 19:331叶绿素含量测定：80%的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80%的丙酮液， 放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度，以80%的丙酮液为空白参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指 导》,P35〜36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca二抗氧化酶活性的定：（2.5g样）L 磷酸缓冲溶液（PBS） （pH=）溶液的配制：65.5506g Na2HP04・12H20 + 2. 65285g NaH2P04・2H20,定容到4L参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P134） 取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50m l的离心管，加入20m l浓度为L磷 酸缓冲溶液（pH=）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用 磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液丙二醛（MDA）的测定：20%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。

参考陈建 勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）；%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20%三氯乙酸（TCA） 溶液溶解并定容到1000ml o （参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）（先 加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；酶液（对照用的L pH二的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡一一沸水 浴上反应30min——冷却（至少30min） ——比色（0D600、0D532、0D450）参考陈建勋， 王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）超氧化物歧化酶（SOD ）的测定：NBT（400ml）混合反应液：392mlPBS（Ph=,+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液 + EDTA-Na 溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）另配）100ml PBS 溶液加 EDTA-Na测试时：取3ml反应液+（根）或ml（叶）粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定 吸光度过氧化物酶（POD）的测定：L 磷酸缓冲溶液（PBS） （pH=）溶液的配制：10.9251g Na2HP04・12H20 + 3.042975g NaH2P04・2H20,定容到 1000ml。

H2O2溶液的配制：吸30%H2O2，用L pH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250ml愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用L pH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250ml2ml %H2O2溶液+ %愈创木酚溶液+ 1ml L pH=磷酸缓冲溶液（PBS） + ??（原来为）酶 液（根加酶液）（对照用L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处0D降低速 度将每分钟0D增加定义为1个活力单位参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验 指导》P121）比色时加酶液，混合后即刻计时脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）0H2O（ml）0冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）3333333脯氨酸含量（ l01246810酶液（对照用80%乙醇代替）（做三个重复）+ 1ml冰乙酸+显色液 混匀，沸水浴15min,冷却后测0D520可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）牛血清白蛋白：配成100|i g/ml和1000|i g/ml90%乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水85%（W/V）磷酸：170m丨磷酸+ 30ml蒸馏水。

考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷 酸200ml,用蒸馏水定容到2L常温下可保存一个月标准曲线的制作：配制0〜100|! g/ml血清白蛋白血液管号123456100|i g/ml牛血清白蛋白（ml）0蒸馏水量（ml）0蛋白质含量（ml）0配制0〜1000|i g/ml血清白蛋白血液管号7891011 12100 g/ml牛血清白蛋白(ml)0蒸馏水量（ml）0蛋白质含量（ml）0酶液（做三个重复）+ 5ml考马斯亮蓝G-250 混匀，放置2min后在595nm下比色过氧化氢酶（CAT）的测定：%H202溶液的配制：吸5ml 30%H202，用L pH二磷酸缓冲溶液（PBS）定容到500ml1 ml %H2O2溶液+ H2O + ml酶液，测定240nm处0D降低速度将每分钟0D减少定义 为1个活力单位参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P125） 5%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。

10%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml150mmol/L NaH2P04 （pH ）溶液的配制：100ml44% H3PO4溶液的配制：250ml4% 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml3% FeCl3溶液的配制：100ml首先标制作准曲线粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入 15m 5%三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高 使酶失活），研磨（用磨碎机磨）,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶 液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。