细胞培养的操作流程.docx

实验题目：细胞传代实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml, 10ml）, 50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅， 记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也 将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法同时也是利用培养细胞进行各种 实验的必经过程实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤一. 实验前准备工作：进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37 °C水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋二•.准备实验：先关闭紫外等30min后再进行实验；75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出1. 吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细 胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸 里。

注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大2. 消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混 匀，放于37C孵箱中消化5-6min取下用后的移液管3. 中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中4. 离心收集细胞：配平后离心200xg, 3min将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL /瓶（培养瓶底面 积为 25cm2）5. 重悬细胞：离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）加入新DMEM培养液（按 2mL/瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复吹打使细胞充分混匀，要尽量 减少产生气泡6. 分装：混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀记号笔标记细胞名称，培 养液，细胞传代数，传代日期，实验人员7. 培养：将细胞放于37°C,4% CO2细胞培养箱培养将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4°C冰箱 中保存8 .清洁安全柜实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。

9.观察：每天观察细胞，并记录细胞生长状态实验注意事项：1. 紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害一般情况下，消毒后至少半小时后再进 入2. 所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注 意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起3. 细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速不能太高， 实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是 一个一个的4. 传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染所有操作要尽量靠近酒精灯火 焰每次最好只进行一种细胞的操作每一种细胞使用一套器材培养用液应严格分开5. 每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生 长致密时即可传代实验题目：细胞复苏实验原理：细胞复苏的原则一快速融化：必须将冻存在-196°C液氮中的细胞快速融化至37^，使细胞外冻存时的冰晶迅 速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害实验材料：水浴锅，安全柜，冻存细胞，细胞冻存管，培养瓶，移液枪，移液管（5ml，10ml）， DMEM细胞培养液，细胞培养箱实验操作：一. 实验前准备：1. 将水浴锅预热至37C2. 用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶二. 取出冻存管：1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号2. 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞.三. 迅速解冻：1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速 融化同时配培养液：向50mL离心管内加入9mlDMEM细胞培养液+1mL血清+100uL抗 生素2. 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台 内向离心管中加入4mL培养液，充分混匀四. 平衡离心 配平后，放入离心机中200xg，离心3min五. 制备细胞悬液：1. 吸弃上清液（先吸出气泡）2. 将剩余的6mL细胞培养液加入到离心后的细胞中，使细胞重悬，充分混匀六. 细胞计数：细胞浓度以5x105/ml为宜七. 培养细胞将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，培养瓶标明细胞名称，培养液，实验人员， 实验时间；将培养瓶放入37°C和4%CO2的培养箱内培养24-48h后换液继续培养培养， 换液的时间由细胞情况而定实验注意事项：1. 一定要提前打开水浴锅，预热到37Co2. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

3. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染4. 依据冻存细胞相应的培养基种类、血清种类和其它指定的成份和比例，制备培养基绝大 多数的细胞均无法立即适应不同的基础培养基或不同的血清种类，若因实验需要，必须有 所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，进行所需之实验5. FBS （fetal bovine serum,胚牛血清）,CS （calf serum,小牛血清）和 HS （horse serum,马血 清），对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定的血清种类培养6. 取出冷冻管，立即放入37 °C水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染实验题目：细胞冻存实验原理：细胞冻存的基本原则是缓慢冷冻，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚飒作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水 的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成， 从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤实验材料：安全柜，离心机，恒温水浴锅，冰箱（4C、-20C），显微镜，培养箱，液氮罐， 吸管，培养瓶，枪头，移液管，50ml离心管，冻存管（1〜2ml）微量加样枪， 记号笔，移液枪，培养液，胰蛋白酶（0.25%），DMSO （分析纯）冻存盒（异丙 醇冻存盒。

异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，直接从室温放进 -80 C可以达到近似于1C/min），四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO、20%小牛血清的冻存培养液4mL2. 取出生长良好的细胞3. 吸除旧的培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细 胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里4. 消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶，混匀，放于37C 孵箱中消化5-6min取下用后的移液管5. 中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL 培养液终止消化4. 离心收集细胞：配平后离心200xg, 3min将新培养液加入新培养瓶中，2mL /瓶（培养瓶底面积为25cm2）5. 分装冻存：将细胞分装入冻存管中，每管1mL6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：细胞冻存盒，里面有异丙醇，直接放入-80过夜，冻存盒自动缓慢降温然后-196°C 液氮保存实验注意事项1. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期 细胞。

在冻存前一天最好换一次培养液；2. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3. 冻存要用新配制的培养液实验题目：细胞转染实验材料：Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000;质粒，欲转染的细胞实验步骤：以24孔板为例说明转染具体步骤（24孔板每孔面积为2cm2）一. 实验前准备：转染前一天，按照细胞传代的方法，收集细胞，用培养液重悬细胞，并对细胞计数，细胞铺 板使细胞密度为1-4x105细胞/ mL培养液，使其在转染日密度为90%〜95%细胞铺板含血 清，不含抗生素的正常生长的培养基中二. 稀释：1 .对于每孔细胞，使用50gl无血清培养基（如Opti-MEM I培养基）稀释0.8gg DNA2.使用Lipofectamine 2000前应轻轻混匀，对于每孔细胞，使用50gl OPTI-MEM I培养基 稀释 2pl Lipofectamine 2000 试剂Lipofectamine 2000 稀释后室温保温 5min3 .在25min （保温时间过长会降低活性）内将稀释的Lipofectamine 2000同稀释的DNA轻 轻混合，室温下保温20min。

复合物可以在室温保持6小时稳定注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEM I稀释，细胞也可以使用DMEM培养如 果DMEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5min内同稀释的DNA混合混合稀释的DNA （第2步）和稀释的Lipofectamine 2000 （第3步）在室温保温20min注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染4. 直接将复合物加入到每孔中，来回摇动培养板，轻轻混匀注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板在加入复合 物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基5. 在37^，5%的CO2中保温24-48h，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更 换生长培养基也不会降低转染活性6. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基 因活性这依赖于细胞类型和启动子活性对稳定表达的细胞，在开始转染24h后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素 进行稳定表达需要数天或数周实验注意事项：1. 细胞的状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。

有文献说传代不要超过17代我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好， 不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了2. 细胞的融合度细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的3. 转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素浓度不要低于0.35ug/ul。