血清成分分析Serumcomponentanalysis.ppt

血清成分分析血清成分分析 （（Serum component analysis））<朱素素>指导老师：吴明江实验内容实验内容w血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）w血清清蛋白与血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定球蛋白的分离与鉴定 w血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）醛法） ◆胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定100mL样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系1.1.邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线及样品的测定数邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线及样品的测定数邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线及样品的测定数邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线及样品的测定数据据据据 2.2.实验结果实验结果实验结果实验结果w由标准曲线可知：w1.加入邻苯二甲醛试剂的未免疫样品溶液含胆固醇约为（71-51）=20mg/100ml.w2.加入邻苯二甲醛试剂的4号免疫样品溶液含胆固醇约为（100-58）=42mg/100ml.◇可知4号免疫的兔子血清的胆固醇含量比较高。

据所查到的资料，免疫系统的激活能阻碍肝脏清除胆固醇的能力 3.3.结果分析结果分析结果分析结果分析4.4.误差分析误差分析误差分析误差分析w1.因为光的波长不同，其吸光系数亦不同故应保证同组样品在同一波长下进行测定并注意每次调零操作w2.血清总胆固醇的测定中受水分影响很大，因此所用试管，比色杯必须干燥w3.低温下，胆固醇在无水乙醇中溶解度降低，因此用无水乙醇提取胆固醇应在10°C以上的室温下进行◆血清清蛋白与血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析，透析，浓缩球蛋白的盐析，透析，浓缩 盐盐析析：高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素——水化膜和胶粒上的电荷，使蛋白质凝聚、沉淀 透透析析：高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀 浓缩浓缩：利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩 血清清蛋白与血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与球蛋白的分离与鉴定鉴定 离心分离一次，得①上清液（这要是含清蛋白）和②沉淀（主要是含γ-球蛋白 ） ↓对①离心，透析，浓缩得较纯清蛋白；对②离心，透析，浓缩得较纯γ-球蛋白 ◆◆凝胶层析凝胶层析 凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。

当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚 洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的应用w⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性 w⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯w ⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。

w⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液1.1.实验结果实验结果实验结果实验结果w凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等w本次实验没有测出光度值，是以试管的编号数为横坐标，每一试管的颜色深浅程度为纵坐标描绘的洗脱的曲线，可以有图得知在蓝葡聚糖在第17管达到洗脱峰，重铬酸钾在第36管达到洗脱峰2.2.结果分析结果分析结果分析结果分析 本次实验由于在加蓝葡聚糖和重铬酸钾混合液时，没有等到混合液先沉到洗脱液底部，即凝胶面的表面，就开始加继续加洗脱液进行洗脱，致使混合液被稀释了一些，造成样品扩散加剧、区带变宽，降低了分辨率，而且实验时间会大大延长。

2.2.误差分析误差分析误差分析误差分析w1.加样前要尽量快速、均匀另外加样品量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样品量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大w2. 洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好◆◆血血清清清清蛋蛋白白与与γ-球球蛋蛋白白的的鉴鉴定定（（醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜电泳法）电泳法） 醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜电电泳泳法法:醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法醋酸纤维素薄膜是用二乙酸纤维素制成的，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为取代电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用广泛、没有吸附等特点 浸泡→ 点样→ 电泳→ 染色→ 漂洗 1.1.实验结果实验结果实验结果实验结果2.2.结果分析结果分析结果分析结果分析 通过电泳分离出来了γ-球蛋白和清蛋白。

全血清的电泳有五条蛋白带，清蛋白、α1、α2、β及γ-球蛋白本次实验γ-球蛋白的电泳带有两条，通过与全血清的电泳带对比可知是清蛋白因此可知是第一次离心分离上清液和沉淀的时候沉淀中有带有清蛋白，并没有分离彻底3.3.误差分析误差分析误差分析误差分析1．醋酸纤维膜孔隙小，含水量少，而且较薄，所以它对热很敏感，故应注意控制电压、电流 2．样品不可过多，只需几微升即可 3．加样一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪 4．注意醋酸纤维膜的质量，浸泡很久仍有大块白色硬点者可弃之不用血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定◆谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法） 将谷氨酸和丙酮酸与肝匀浆一起保温，在肝细胞的丙氨酸转氨酶催化下产生丙氨酸利用纸层析法鉴定丙氨酸的存在，证明组织内的转氨基作用为了防止底物丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加溴乙酸抑制糖的酵解作用和氧化作用 谷氨酸和丙氨酸是理化性质不同的两种氨基酸，前者为亲水性氨基酸，后者为疏水性氨基酸，据此二者在固定相（水）与流动相（酚试剂）中的分配程度不同，因而流速不同最后用茚三酮显色 1.1.实验结果实验结果实验结果实验结果2.2.结果分析结果分析结果分析结果分析w由图可知对照管没有丙氨酸产生，测试管有丙氨酸产生。

样品的浓度有些稀对照管有没有丙氨酸产生是因为酶液在沸水中煮过失去活性了，测试管的酶是具有活性的，因此谷丙转氨酶能够催化谷氨酸转变成为丙氨酸 3.3.误差分析误差分析误差分析误差分析w1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）w2．点样斑点不能太大（直径应小于0.3 cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄w3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中w4．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的且展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果◆血清谷丙转氨酶活力单位测定血清谷丙转氨酶活力单位测定 本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数 1.1.酶活力标准曲线数据及样品实验结果酶活力标准曲线数据及样品实验结果酶活力标准曲线数据及样品实验结果酶活力标准曲线数据及样品实验结果2.2.结果分析结果分析结果分析结果分析w有标准曲线可得：w1.未免疫对照管的酶活力单位数是142U。

w2．4号免疫管的酶活力单位数152Uw本次实验可知免疫组的酶活性大一些3.3.误差分析误差分析误差分析误差分析w1.所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、2，4-二硝基苯肼等均需冷藏；w2.为防止溶血及其他因素对酶活性影响，实验所用器皿应干净、干燥方可使用；w3.丙酮酸钠极易变质，配试剂时应选择外观洁白干燥者，否则应进行重结晶；w4.转氨酶只能用于α-L-Ala，对D-Ala无催化作用w5.如活性高于500U/100mL，应将血清稀释一定倍数重新测定，结果应×稀释倍数；w6.为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定pH、保温时间；w7.选用固定分光光度计及比色杯减少误差谢谢谢谢。