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茎尖的冷冻疗法：新型的病原体消灭方法王乔春，Jari P.T. Valkonen冷冻疗法是植物超低温保存技术的一种新的应用，它能消灭高频的病原体冷冻疗法使用 植物超低温保存的方法把茎尖暂时的存放在液氮中，它消灭像病毒、植原体、细菌等植物病 原体健全的植物从存活的无菌分生组织中再生这个方法有利于处理大量的样本，同时不 受茎尖大小的影响它有可能取代更多的像分生组织培养之类的传统方法 冷冻疗法的目标无菌的种植材料对于农林作物的生产率和观赏植物的价值是非常关键的植物生长特别容 易积攒病原体，由被感染的插条，块茎，和其它的繁殖体传送到新的作物中植物种植资源 的保存是未来繁殖新的栽培品种的基础之一，但是种质的收集不应该无意中构成病原体的来 源，在种质的繁殖过程中传播到新的区域因此，基因库也需要有效的方法来提高种质收集 的植物检疫状态茎尖的冷冻疗法是一种用于消灭植物病原体的新型的技术最近,冷冻疗法已经被证实可 以根除七组不相关的病毒和/或两种类型的细菌像茎尖的根和块茎作如土豆（马铃薯；茄科）， 甘薯（白薯；缠绕植物），葡萄藤（葡萄；葡萄科），果树包括柑橘（芸香科）和李属（蔷薇科）、 浆果植物（覆盆子、悬钩子属植物;蔷薇科）和香蕉分生组织（芭蕉属;芭蕉科）等的病原体。

这 些植物代表六个整体和一些世界最重要的农作物，对于食品供应（马铃薯、甘薯和香蕉）和贸 易（柑橘和核果类果树）而言广泛使用的冷冻疗法是有可能的,因为它依赖于植物超低温保存 的协议，可应用于许多额外的重要经济的，生长的传播植物，包括单子叶植物（比如芦笋， ［芦 笋地榆科］和大蒜［大蒜］）、草（如Conadyn,结缕草和黑麦草），甘蔗（糖,高良姜），百合（百合 科）,兰花（兰科）、菠萝（菠萝科］,芋头（芋科）、草本物种（例如啤酒花］）,土豆（Solenos temon rotundifolius［波］J.K•莫顿）、薄荷、木瓜（番木瓜）、天竺葵属植物，（补血草属），草莓（草莓 属）和芥末酱（芥末）,以及木本植物包括杜鹃（杜鹃花）、银桦木（桦木属.）,栗,橄榄（齐墩果欧 洲 ）,杨树（杨树.）和许多其他的物种.茎尖或分生组织体外培养已经被使用了几十年从生长地传播植物消除病毒［12］茎尖用 于微体繁殖在结构上定义为结构,包括顶端或侧枝分生组织（1-1.5毫米大小），三到四叶原 基［13、 14］.最年轻的分生细胞通常是对于病毒和其他专性寄生虫,如菌原体和细菌是有免疫 力的因此, 切除和再生微小的分生组织可能导致植物没有这些病原体。

再生能力对于茎尖大 小是成正比的，但是使用小的茎尖（0. 2 - -0. 4毫米）对于病原体的根除是更有效的由于切 除非常小的分生组织来移除受感染组织和确保微小的分生组织的生存和再生是有困难的，因 此, 使用分生组织培养根除病原体是有挑战的冷冻治疗的一大优势是，它有利于治疗大量的样品，因为病原体时代通过该方法是独立 的二价阳离子的大小芽提示使用［3,5,6,9,10］冷冻治疗，感染的细胞消除超低温和/或以后 变暖的致命影响；没有必要的机械拆除，冷冻治疗后茎尖再生的数量可能比茎尖培养后少，但 这种差异可以被弥补，因为冷冻治疗可以更加容易的切除较大的茎尖和获得免费的较高比例 的冷冻再生剂［3,5,6,9,10］ 因此，冷冻治疗的另一个优点是，与传统的分生组织培养相比， 冷冻治疗需要更少的再生芽，而这些再生芽是需要被索引的病原体来识别这些免费的病原体a)Cells are smaller, more isodiametric in shape and possess a larger nucleo- cytoplasmic volume ratio. Vacuoles are small and scattered through the protoplast.TRENDS in Plant ScienceCells at basal layers of AD and upper part of LPShoot tip before freezing (Pathogen-infected)Shoot tip after freezing (Pathogen-free)Cells are larger, contain larger vacuoles, and have a smaller nucleo-cytoplasmic ratio.Cells at top layers of AD and basal part of LPCryotherapyFigure 1. Elimination of infected cells by cryotherapy of shoot tips. (a) Overview of the main steps of the procedure. (b) Schematic illustration of the anatomical differencesbetween the cells of the meristematic zone in apical dome (AD) and other, more differentiated cells in the shoot apex. The least differentiated cells close to the AD of themeristem are packed closely together without intercellular cavities, are small and isodiametric in shape, and possess a large nucleo-cytoplasmic volume ratio. Vacuoles aresmall and scattered in the cell. The protoplasm contains a large number of cell organelles such as proplastids, mitochondria, Golgi apparata and ribosomes associated withthe endoplasmic reticulum [20]. The sizes of cells and vacuoles increase, the nucleo-cytoplasmic ratio decreases and the propensity for injuries at ultra-low temperaturesgrows with increasing distance from the AD [8,16]. For successful cryotherapy, lethal intracellular injury of the pathogen-infected cells should be promoted to remove them.It can be enhanced by combinatorial use of thermo- and cryotherapy [8]. Abbreviations: AD, apical dome (top layer of cells of the apical meristem); HC, healthy cells; KC,killed cells; LP 1, leaf primordium 1 (the youngest leaf primordium); LP 2, leaf primordium 2; M, mitochondria; N, nucleus; Nu, nucleolus; P, proplastid; PIC, pathogen-infected cells; SC, surviving cells; V, vacuoles.在对细胞冷冻保存时，细胞需要容忍超低温的液态氮（T96°C）环境，为了使细胞脱水， 通常采用传统的冷冻技术或者现代的玻璃化方法来使细胞脱水。

这些治疗方法之所以被应用， 是为了防止冰晶在细胞中形成，继而减轻对细胞器和膜的损伤，并且还可以促进细胞的存活 [13]，分生区的细胞和分化的细胞有很多不同，分生区的细胞更小并且有小空泡和更高的细 胞核-细胞质比［8］因此分生组织细胞比被感染病原体的分化细胞更更能承受脱水冷冻疗 法利用分生组织和其他组织的差异来进行生理解剖，并且实现了在一个简短的经过低温处理 的液态氮中破坏细胞分化，感染细胞对本地化的病毒［8,9］和植原体［7］在液氮中进行冷冻 治疗，这是为了获得高比例的无病毒再生剂而不可缺少的治疗茎尖的方法 ［5］，并且根据冷 冻疗法杀死被感染的分化细胞［4］ ［8,16］ 来消除病原体，对受伤的细胞的超微结构的研究与 提出的模型也是一致的幸存的无病原体的分生组织细胞能够自我更新，分化，并产生器官 分化的新芽的子细胞通过该方法再生的芽可以高比例的没有病原体（表1）冷冻疗法的具 体的步骤（图la）,所需的总时间比传统的分生组织培养消灭病原体多了几天，传统的分生 组织培养需要几个星期到几个月，这取决于植物种类 ［12］Table 1. Ef?cacy of pathogen eradication by cryotherapy of shoot tips PlantPlants1Palho^enV1Ciyopreseivation metho 2Banana (NlusayCIMV/BSV%1Mtrificatiorn-130-9.Q>'HFBejing lemon, mandaiin. punmelo. sweetsHLB4orange (Citrus*+■'+■'+■'dGrapevine (X^itis viniferayGVA^-'Encap sulation-vdtiific ation^197*J［呼Potato (Solarum tuberosumyPLRWPVWEncap sulation-vitrific ation^-183仞°时Potato (Solaium tuberosum)^PLRWPVWEncap sulation ・de 月 diatian^-185«lcPotato (Solarum tuberosum^PLRWpyyvDroplet-x-itrific ation^-1Prunus hybrid^PPWVltTification^'75^'PFRaspbeny (Rubus idaeusyE.BDWThermotheiapy followed by ciyotheiapy (encapsulation-*-1 vitrification^133-35^'跡1Sweet potato (Qamoea batatas*SPC SV SPFMVEnc ap sulation-vitrific ation*-'100100PFSweet potato (^)omoea batatas)*-1SPLLdEncap sulation-vdtiific ation^1lOOd卩WaAbbreviations: BSV, Banana streak virus; CMV, Cucumber mosaic virus; GVA, Grapevine virus A; HLB, Huanglongping bacterium; PLRV, Potato leaf roll viru。